RNAi病毒包装.doc

3.RNAi病毒包装 3.1腺病毒包装 3.1.1特点： 几乎可以感染所有类型的细胞。 可以获得复制缺陷型 (E1和E3缺失) 的腺病毒。 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 3.1.2原理： 腺病毒 (Adenovirus，Ad) 是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 3.1.3腺病毒包装简要流程 (以Invitrogen包装系统为例) 构建表达siRNA/miRNA的腺病毒载体。 采用PacI消化纯化的质粒。 消化好的腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。 分装，- 80 oC保存。 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 3.1.4 本公司提供的最终产品包括： 重组后的腺病毒载体质粒以及测序图谱。 产品无菌检测结果。 腺病毒储液及相应的病毒滴度。 我们保证：1) 制备的病毒颗粒携带片段的正确性2) 病毒颗粒的总数和病毒滴度：如无特殊要求我们提供1mL滴度为1×1010 - 1×1012个病毒基因组 / mL的病毒储液。 3.2慢病毒载体包装服务 3.2.1特点： 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 无需任何转染试剂，操作简便。 可以根据客户需要制备多种标记。 3.2.2原理： 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 3.2.3慢病毒包装简要流程： 含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞。 培养48h- 72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。 病毒的纯化和浓缩。 分装、- 80 oC保存。 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 重组后的慢病毒载体质粒以及测序图谱。 产品无菌检测结果。 慢病毒储液及相应的病毒滴度。 我们保证：1) 制备的病毒颗粒携带片段的正确性2) 病毒颗粒的总数和病毒滴度：如无特殊要求我们提供1mL滴度为1×107 - 1×108的病毒储液。 3.3其他类型病毒载体包装 病毒包装的siRNA基因能否对目的靶基因进行有效基因沉默，依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达，而这在很大程度上取决所采用的载体系统。 本公司除了可以进行腺病毒包装和慢病毒包装，还可以进行其他类型病毒包装 (逆转录病毒载体的包装、腺相关病毒包装等)。 3.3.1逆转录病毒 逆转录病毒 (Retrovirus) 是一类已知的RNA病毒。需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。该载体系统有两部分组成，一是带有外源基因的重组反转录病毒载体分子，二是能以反式提供病毒结构蛋白的包装细胞，其要求是能高效产生感染靶细胞的重组病毒颗粒，且无野生型的反转录病毒存在，后者是基因治疗安全性的关键问题。 逆转录病毒载体最大优点是: (1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等; (2) 转入的外源基因可完全整合; (3) 对细胞感染率高，达到100 %; (4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。 逆转录病毒载体的不足之处，如: (1) 只能整合至分裂期细胞; (2) 可插入外源基因片断小（10kb），难以满足较大基因的插入; (3) 病毒滴度是限制临床应用的主要方面; (4) 有产生野生型病毒或辅助型病毒的可能，随机整合可能产生不良作用。 3.3.1腺相关病毒 腺相关病毒因其能将外源基因定点整合至宿主细胞上，因而具有一般病毒载体所不具有的特性。腺相关病毒（Adeno - associated virus，AAV