第7章 H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒.docx

H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书?【产品名称】通用名称：H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）英文名称：Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing) ?【包装规格】大包装，48反应/盒【预期用途】流感病毒可分为甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。其中，甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分为1-16种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白（NA）的不同可分为1-9种亚型，HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一种。H7N9流感病毒既可以感染禽类，也可以感染人。人感染H7N9禽流感会出现严重肺炎，症状包括发烧、咳嗽、呼吸困难等。本试剂盒适用于检测呼吸道样本、血清、肺组织等样本中H7N9禽流感病毒RNA，可用于该病毒感染的实验室诊断和宿主动物的监控。检测结果仅供研究，不用于临床诊断。【检验原理】本试剂盒基于实时荧光PCR技术，分别选取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守区作为扩增靶区域，设计特异性引物探针，通过一步法实时荧光PCR体系扩增对H7N9禽流感病毒进行定性检测。反应体系中除特异性引物和特异性荧光探针外，还配以对应的PCR反应Buffer、逆转录酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸单体（dNTPs）、Mg2+等成分，可实现对H7N9禽流感病毒核酸灵敏特异地检测。【主要组成成分】组分名称规格数量PCR检测试剂AIV H7 PCR反应液A816μl/管1AIV N9 PCR反应液A816μl/管1AIV H7N9 PCR反应液B288μl/管1AIV H7N9内标溶液240μl/管1质控品阴性质控品? 200μl/管1AIV H7N9阳性质控品200μl/管1?【储存条件及有效期】保存于-20±5℃，反复冻融次数＜5次，有效期9个月。【适用仪器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等荧光定量PCR仪。【样本要求】1 适用样本类型：呼吸道样本、血清、肺组织。2 样品采集、保存与运送。标本采集、保存、运送请遵循《人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》。【检验方法】1.核酸提取建议取200μl液态样本进行核酸提取；组织样本可以研磨液进行提取操作。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，若提取试剂盒中未说明内标的使用方法可在每200μl样本中加入4μl内标溶液后进行核酸提取。本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；AIV H7N9阳性质控品不参与提取，用于PCR检测试剂的质控。2.PCR扩增（ABI 7500仪器操作为例，ABI 7300、LC480等仪器参照此操作及仪器操作手册）2.1分别配制AIV H7 RT-PCR反应体系和AIV N9 RT-PCR反应体系2.1.1 AIV H7 RT-PCR反应体系配制取适量PCR反应管（按AIV H7反应体系计算）；每管加入AIV H7 PCR反应液A 17μl、AIV H7N9 PCR反应液B 3μl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20μl于单个PCR反应管中）。2.1.2 AIV N9 RT-PCR反应体系配制取适量PCR反应管（按AIV N9反应体系计算）；每管加入AIV N9 PCR反应液A 17μl、AIV H7N9 PCR反应液B 3μl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20μl于单个PCR反应管中）。2.2 于上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、AIV H7N9阳性质控品、待测标本核酸各5μl，8,000rpm离心数秒，放入PCR扩增仪。2.3探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反应条件设置为：50℃ 15min，1个循环；95℃ 15分钟，1个循环；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集荧光），45个循环。保存文件，运行。3.结果分析3.1 反应结束后保存检测数据文件。 3.2 分析条件设置：根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲