农杆菌介导法将Bt毒蛋白基因导入水稻的分析.pdfVIP

农杆菌介导法将Bt毒蛋白基因 导入水稻的研究 摘要 本文以当前培育超级杂交稻正在广泛使用的两个优势亲本培矮64S和9311 作为主要研究对象，对影响其成熟胚来源的愈伤组织诱导、分化和植株再生条件 进行了优化；对影响农杆菌转化上述籼稻的条件进行了探索和优化：建立了高频 的离体再生系统和比较高效的遗传转化方法。同时对转基因植株进行了分子检测 和抗虫性分析。 1．培矮64S和9311离体再生系统的优化 研究了影响两种籼稻愈伤组织诱导、继代和分化成苗的相关因素，结果表明： 种子本身的生理状态是影响愈伤组织诱导频率的主要因素之一；将N6培养基的 大量元素与MS微量元素组合，同时提高VBI和肌醇的含量可显著提高愈伤组 织的诱导和培养效果；在合适的2,4．D浓度下，添加其他外源激素不能显著提高 愈伤组织的诱导率，但可改善愈伤组织的胚性生长状态；交替使用不同的培养基 成分和激素浓度配比可使长期继代培养物保持胚性状态，延长继代培养的时间： 预分化和干燥处理使植株再生的频率和质量大大提高。 采用我们优化后的培养条件与处理方式，培矮64S和9311愈伤组织的诱导 频率分别可达到62．45％和85．30％；继代培养时间达三个月左右仍能保持较好的 胚性生长状态；对于继代两次胚性生长状态良好的愈伤组织分化频率分别可达到 85．5％和87．7％。 2．采用农杆菌介导法将Bt毒蛋白基因导入水稻 同样以上述两种籼稻为主要研究材料，比较了分别以预培养的幼胚和幼穗、 幼胚、成熟胚来源的愈伤组织作为转化受体的愈伤组织转化频率，结果表明预培 养4-6天的幼胚最适宜作为农杆菌介导转化的受体；其次是来源于幼胚和成熟胚 的生长状态良好的胚性愈伤组织。 液浓度为OD值=O．8时，愈伤组织的转化率最高。 在农杆菌侵染愈伤组织过程中，通过负压处理可明显提高水稻愈伤组织的转 化频率。对于60ml的注射管而言，抽拉距离确定在6cm左右，抽拉次数40次 对提高水稻愈伤组织的转化频率最为有效。 采用Ca2+和表面活性剂处理以提高转化频率是本实验的重大创新。在愈伤 和9311胚性愈伤组织，同时在处理液中添加0．1％Tween20以降低细胞的表面张 力，对促进愈伤组织的转化和转化植株的再生效果最好。经上述处理可使9311 愈伤组织的转化率和抗性植株再生率分别达到58．33％和33．33％。 检测结果表明，绝大部分经抗性筛选得到的转化植株的基因组中已整合有外源基 因。 关键词：籼稻，愈伤组织，农杆菌，转化，抗虫 lI into Gene on Bt-toxin Studies Introducing via Rice tumefaciens Agrobacterium Abstract of ontwovarietiesofindica Two researchwere rice(Oryza aspects performed sativa 9311 whichwere as extensively L．)Pei’ai64S(PA64S)andemployed results current in