单核细胞TLR7和TLR8的表达及功能与HIV感染关系的分析.pdfVIP

·中文论著摘要· 单核细胞TLR7／8的表达及功能 与HIV感染关系的研究 目 的 近二十年来研究者们一直致力于获得性免疫对HIV感染的免疫应答研究，但 到目前为止在免疫治疗和疫苗方面尚无突破性进展。近来研究显示，在HIV感染 中天然免疫系统可能占有非常重要的地位。天然免疫系统即是机体抵御外来病原微 生物入侵的第一道防线，同时又在调节获得性免疫中发挥着重要的作用，单核细胞 7and Receptor 长末端重复序歹U(HIV-1 和8的表达是否与HIV感染的疾病进程有关，是否为HIV感染者疾病进展缓慢的 保护因素，目前尚无文献报道。TLR7和8的表达水平能否影响其介导的单核细胞 分泌的细胞因子水平，亦无文献报道。TLR7和8介导的NF．r,B的活化能够同时促 进I型和II型细胞因子的产生，且在HIV-1LTR上存在着NF．r,_13的结合位点，能 作用，那么它如何影响HIV的复制呢?目前尚无明确的结论。本文首次研究了不 同疾病进程的HIV感染者单核细胞的TLR7和8表达水平和其介导的细胞因子分 泌功能以及对HIV复制的影响，初步探讨了HIV感染者单核细胞TLR7和8表达 及其介导的信号对HIV感染疾病进程的影响及可能的致病机制。 方 法 1、研究对象 由辽宁省疾病预防与控制中心，河南省疾病预防与控制中心和中国医科大学艾 滋病研究所艾滋病确认实验室经Western 患者。根据HIV／AIDS患者CD4+T细胞数量和感染时间不同，分成三组：缓慢进 10年以上，未经抗病毒治疗，无艾 展组，CD4+T淋巴细胞500个仙l，感染HIV 滋病指征性症状：HIV感染组，CD4+T淋巴细8_200个似，无艾滋病指征性疾病； 的健康对照来自本院健康体检门诊的体检者，血液系统及肝肾功能检查结果正常， 无免疫系统000疾病史。 2、标本采集 用lO毫升EDTA抗凝负压真空采血管采集研究对象外周静脉血，在6小时内 进行试验。 3、T淋巴细胞绝对值和比值测定 CD4／CD8／CD3 将201xl TriTEST试剂加入绝对计数管中，应用反向加样法加入 5min，FACS 501al抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素4501xl，室温避光1 MULTISET软件检测并进行自动分析，计算CD4+T淋巴细胞绝对值。 4、密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 入另一试管中。加入5倍体积的PBS缓冲液，洗细胞2次。 5、CDl4+单核细胞分选 采用德国Miltenyi公司的MACS免疫磁珠分选装置，严格按照说明书进行操 rain， 201．tlCDl4-PE及209l 6、单核细胞体外培养及刺激 HEPES 将分选的单核细胞用含有1％PS，2mmol／L的L．谷氨酰胺，25mmol／L 缓冲液，10％胎牛血清的RPMI1640调整浓度为1x106／mL，培养于48孔板中，所 5％ 用的培养基及材料均不含内毒素。用2．5p∥111l的R848刺激单核细胞，于37C 的C02孵箱中培养，对照组加入同体积的PBS，每个样本设3个复孔，24小时后 收集上清和细胞． 2 7、制备细胞RNA 按照QIAGEN公司细胞RNA提取试剂盒的说明书进行操作，通过全自动紫外 分光光度仪检测所得RNA的质量和浓度。 8、引物及探针的设计和合成 上述引物经BLAST分析，匹配率为100％。 9、标准品质粒的构建 逆转录反应按照TaKaRa公司试剂盒说明书进