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PBMCs细胞的精确计数和活性分析

PBMC 细胞的精确计数和活性分析 一、 PBMC 细胞计数的现状 1. 目前,绝大多数的科研工作者仍在使用血球计数板在 显微镜下进行手工计数 PBMCs; 2. 但是显微镜下由于白细胞和红细胞大小非常接近,不 能完全区分白细胞和红细胞; 3. 通过红细胞的双凹形形态鉴别红细胞,需要经验丰富 的操作者,且不停地调焦来鉴别;可想而知要把每个红 细胞鉴别出来,要耗费多长的时间,需要多强的工作量。 PBMC 样本的差异性大 由于个体的差异 (如正常人和病人)和人工分离提取的差异,红细胞和血小板污染的程度差异性非 常大,因此我们经常看到分离后的 PBMC 样本千差万别,这也大大增加了在同一条件下,简单快速 准确计数 PBMC 的难度和检测 PBMC 活性的难度。 二、 PBMC 精确计数或活力分析的重要性 PBMC (外周血单个核细胞)是免疫学功能研究中最常用的细胞模型,如细胞增殖、细胞毒性、细 胞因子分泌等。 如在癌症免疫治疗领域中,需从病人全血中分离出 PBMC,分离的 PBMC 进一步扩增或进行不同的 功能检测。激活扩增后的细胞再回输到病人体内进行细胞治疗。在整个流程中,从分离到检测,到 培养,到回输等过程,细胞浓度和细胞活力都是必须监测的参数。 密度梯度分离液是从外周血、骨髓,及脐血分离单个核细胞最常用的方法。但是不可避免的,分离 后的细胞中,会有残存的红细胞及血小板混合在单个核细胞中。残存的红细胞和血小板的多少,与 个体的差异,以及分离的效果相关;但是不管分离的技术多高超,经验多丰富,都不可避免会存在 红细胞和血小板的污染。 PBMC 实验的特征 1. 随着时间的延长,细胞质量下降; 2. 临床试验相关的样品量很大; 3. 细胞样品不纯,分离之路依赖病人样本和操作者 如何精确、快速、简便计数 PBMC 以及精确分析PBMC 活力,是免疫学研究以及免疫治疗领域至关 重要的步骤。 1. 使用血球计数板在显微镜下进行手工计数 PBMC,即耗时耗人力,更不能达到精确计数的目的。 2. 通过明场的常规细胞计数仪同样不能区分红细胞,不能达到精确计数 PBMC 和精确活力分析的 目的。 3. 迫切需要快速、简便、精确计数 PBMC 的工具替代人工计数。Nexcelom 公司走在了市场领先的 位置,在常规明场的细胞计数仪基础上,开发出了双荧光细胞活力分析仪,可通过 AOPI 染料进 行 PBMC 的快速精确计数和活力分析。 三、 如何精确计数 PBMC 和活力分析检测 通过 AOPI 染料进行双荧光计数和活力分析,是可以排除红细胞、血小板、细胞碎片等污染的精确 1 计数方法。 AO (吖啶橙)和 PI (碘化丙啶)是可对 DNA 染色的细胞核染色试剂。其中 AO 可以通过完整的细 胞膜,嵌入所有细胞 (活细胞和死细胞)的细胞核,呈现绿色荧光; 只能通过不完整的细胞膜, PI 即死细胞的细胞膜,嵌入所有死细胞的细胞核,呈现红色荧光。 活死单个核细胞可呈现荧光信号。而成熟的 红细胞及血小板,因为没有细胞核,不能被 AO/PI 染色,因此可以完全被排除在外不被 计数。 通过 AOPI 染料进行双荧光计数和活力分析,可以精确计数分离后的 PBMC 以及活力分析,亦可进 行全血中的 。 PBMC

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