PBMCs细胞的精确计数和活性分析.pdf

PBMC 细胞的精确计数和活性分析 一、 PBMC 细胞计数的现状 1. 目前，绝大多数的科研工作者仍在使用血球计数板在 显微镜下进行手工计数 PBMCs； 2. 但是显微镜下由于白细胞和红细胞大小非常接近，不 能完全区分白细胞和红细胞； 3. 通过红细胞的双凹形形态鉴别红细胞，需要经验丰富 的操作者，且不停地调焦来鉴别；可想而知要把每个红 细胞鉴别出来，要耗费多长的时间，需要多强的工作量。 PBMC 样本的差异性大 由于个体的差异 （如正常人和病人）和人工分离提取的差异，红细胞和血小板污染的程度差异性非 常大，因此我们经常看到分离后的 PBMC 样本千差万别，这也大大增加了在同一条件下，简单快速 准确计数 PBMC 的难度和检测 PBMC 活性的难度。 二、 PBMC 精确计数或活力分析的重要性 PBMC （外周血单个核细胞）是免疫学功能研究中最常用的细胞模型，如细胞增殖、细胞毒性、细 胞因子分泌等。 如在癌症免疫治疗领域中，需从病人全血中分离出 PBMC，分离的 PBMC 进一步扩增或进行不同的 功能检测。激活扩增后的细胞再回输到病人体内进行细胞治疗。在整个流程中，从分离到检测，到 培养，到回输等过程，细胞浓度和细胞活力都是必须监测的参数。 密度梯度分离液是从外周血、骨髓，及脐血分离单个核细胞最常用的方法。但是不可避免的，分离 后的细胞中，会有残存的红细胞及血小板混合在单个核细胞中。残存的红细胞和血小板的多少，与 个体的差异，以及分离的效果相关；但是不管分离的技术多高超，经验多丰富，都不可避免会存在 红细胞和血小板的污染。 PBMC 实验的特征 1. 随着时间的延长，细胞质量下降； 2. 临床试验相关的样品量很大； 3. 细胞样品不纯，分离之路依赖病人样本和操作者 如何精确、快速、简便计数 PBMC 以及精确分析PBMC 活力，是免疫学研究以及免疫治疗领域至关 重要的步骤。 1. 使用血球计数板在显微镜下进行手工计数 PBMC，即耗时耗人力，更不能达到精确计数的目的。 2. 通过明场的常规细胞计数仪同样不能区分红细胞，不能达到精确计数 PBMC 和精确活力分析的 目的。 3. 迫切需要快速、简便、精确计数 PBMC 的工具替代人工计数。Nexcelom 公司走在了市场领先的 位置，在常规明场的细胞计数仪基础上，开发出了双荧光细胞活力分析仪，可通过 AOPI 染料进 行 PBMC 的快速精确计数和活力分析。 三、 如何精确计数 PBMC 和活力分析检测 通过 AOPI 染料进行双荧光计数和活力分析，是可以排除红细胞、血小板、细胞碎片等污染的精确 1 计数方法。 AO （吖啶橙）和 PI （碘化丙啶）是可对 DNA 染色的细胞核染色试剂。其中 AO 可以通过完整的细 胞膜，嵌入所有细胞 （活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光； 只能通过不完整的细胞膜， PI 即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。 活死单个核细胞可呈现荧光信号。而成熟的 红细胞及血小板，因为没有细胞核，不能被 AO/PI 染色，因此可以完全被排除在外不被 计数。 通过 AOPI 染料进行双荧光计数和活力分析，可以精确计数分离后的 PBMC 以及活力分析，亦可进 行全血中的 。 PBMC