抗冻蛋白基因对山杨等植物遗传转化的分析.pdfVIP

摘 要 克隆得到抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)基因，并通过农杆 菌介导法将它导入杨树，培育抗寒冻的杨树新品种是本研究的主要目的。 研究内容如下： 首先利用RT—PCR方法从胡萝p中克隆到抗冻蛋白基因，并构建了植 EHAl05中，构建了双元转化载体。经生根筛选及PCR检测，证明胡萝b AFP基因已整合入烟草基因组。该工作证明了构建的载体是正确的并在植 物中是有效表达的，这为培育高度抗寒耐寒作物、树木新品种提供基础， 也为进一步研究抗冻蛋白基因的表达及其功能奠定了基础。 本实验建立了山杨(Popu}us．davidfanaDode)叶片高效再生系统， 选择激素浓度、基础培养基、琼脂浓度、蔗糖浓度等因素进行比较，实验 导山杨叶片不定芽分化的培养基，分化率达95％以上。通过卡那霉素敏感 性实验，确定山杨叶片分化与根系对卡那霉素的忍耐极限分别为50mg／L， 15mg／L。 在建立山杨叶片高频再生系统的基础上，利用农杆菌介导叶盘法开展 了AFP基因转化杨树的研究。确立了山杨叶片高效的遗传转化体系：将山 —0．5；侵染时间为8—10min；共培养3d。经过叶盘不定芽诱导的卡那 霉素60mg／h、80mg／L90天连续筛选，获得4株卡那霉素抗性植株，其中 一株，经PCR检测为阳性，初步证明AFP基因己转入山杨中。 关键词胡萝hAFP基因；RT—PCR：克隆；载体构建；山杨；叶片再生； 遗传转化 ABSTRACT a forantifreezeand itinto C10Bing introdueing gene pretein offersa forfreeze poplar ur]iqueopportunitY freeze esWONldthusbeeeonomi ofreealcitrant poplarspeei callY attractive． First，antifreeze wasisoIatedfromDaucus protein(AFP)gene RT—PCR i careta andconstruetedt intothe by plantexpression vectorPBll21，whichthenwastransformedinto EHAl05 c tobacoowere tumefacienbyelectroporation．Transgeni obtained transfermationfrom byAgrobaoterium—mediatedsystem leafdiscs．Thesethatthe i onvector tobaeco proved plantexpress cail in will for expressedeffectuallYplants．Thisprepareplants and ofrecalcitrantfreeze transformation pr