抗寒基因表达载体构建及遗传转化分析.pdfVIP

中文摘要 抗寒是许多蔬菜和大田作物需要的一个重要农艺性状。，利用导入冷应答转录因子基因 (CBF)来从转录水平上促进植物自身的大量冷诱导基因表达，并结合导入l～2个高效抗 寒基因的策略，是当前植物抗寒遗传改良的基本方向，可能成为有效改善植物抗寒性的重 ．、要途径。》’一)7 巧 和低温下超表达时对转基因植株表型及抗寒性的影响等三个方面考虑，构建了相关抗寒基 转化黄瓜和小番茄外植体材料，检测GUS基西的瞬同表达活性，初步探讨了冷诱导启动子 黄瓜和小番茄进行遗传转化，建立了黄瓜高频再生和遗传转化体系，获得了一株转基因黄 瓜植株，并通过了植物基因组PcR检渊；获得了两个具有Kan抗性的小番茄再生绿芽。主 要研究结果如下： 1 冷诱导基因RD29A启动子片髋竹秉眙咻扮躺、．痒罚溽定及分析 聚合酶，从拟南芥(ArabYdopMs 出目的片段。纯化钓目标产物经Ttul蜊^、聚合酶加气碱基后，采用TAClonging方法克隆 菌落进行ColonyPCR筛选和质粒的酶切验证。挑选有插入P—RD29A启动子片段的重组子 单菌落，委托上海搏亚生物工程有限公司测序．结果表明，该目的片段为890bp，与发表 的拟南芥菜P·髓29A(D13044)相应序列一致．，P—7， 2转录爵予嘲基因的竞隆、序列灞定和分析 7根据己发表的拟南芥转录因子翻忍基因序列设计两个特异性引物P。(5’一 海生工生物工程有限公司碧醮謦．结果表明，所克隆的嚣的片段为760bp，编码216个氨基 ’’ 3植物表达载体的构建 ‘ ， 的CaMV 1 酶切后回收CaMV 经连接构建成携有35s—cBF3一Tnos基因表达盒的中间载体pVCT2014。 4冷诱导启动子P_R吆9^在黄瓜和小番茄中的冷诱导表达特性‘ ?以1天龄的黄瓜子叶和小番茄试管菌真叶为无菌外植体材料，分别经活化的农杆菌 导和25℃常温处理后组织化学染色。结果表职，冷诱导启动子P-liD29A在黄瓜和小番茄中 均具有冷诱导活性，受5℃的低温诱导表达，而在25℃常温下不表达．■—、’7一 ／ i 5植物表达载体pBI斛-鼬静彻对黄瓜的遗传转化研究 ；以1天龄的黄瓜子叶为外植体，以船为基本培养墓，通过加入不同浓度组合的BA和 N从j筛选到了试管苗生长最适培养基(1／2Ms附加3％蔗糖孵固体培养夔)和根生长最适 培养基(1／2MS附加0．5ⅡIg／LK^A的液体培养基)． 在最适培养基上研究了黄瓜子叶外植体对卡鄂霉索的敏感性、预培养天数、共培养时 间及感菌时间等因素的影响，建立了黄瓜高频转基西再生律系，即取l天龄的黄瓜无菌子 BA+lmg／LABA+2mg／LAg∞，的固体培养基)上预 叶在芽分化培养基MSK(MS+Img／L Carb的峪K培养基上延迟培养一 分钟，在MSK培养基上暗培养2～4天，在附加300mg／L Carb)中筛选抗挂禽伤和抗性芽， 周后，转入筛选培养基(硒K+90mg／LRan+赫,g／L 每两周更换一次培养基，抗性芽转入试管菌生长培养基中培养l～2周，然后转入生根培 养基中诱导生根，从而获得具有Karl抗性的黄瓜转基因再生菌．1，共获得4株转基因再生植 株。取植株叶片用cTAB法提取基因缎DNA，以Ca}ff35S启动予的引物P每和a隅基因3 ’端引物P。为成对引物进行PCR扩增。结果表明，有一株再生撼探舶基医缀DNA能扩增出 828bp的条带，与阳性质粒对照处于同一位置，证咀目的基因已经转入燹瓜基因组中。)i印 6植物表达载体pBIN+-35S-CBF3对小番茄的遗传转化探讨 -以小番茄试管菌幼嫩真叶为外植体，以MS为基本培养基，通过加入不同浓度组合的 BA和ZT，筛选到