猪传染性胃肠炎检测试剂的研制及快速诊断方法的分析.pdfVIP

摘要 N蛋白，经Ni2+-N1‘A金属螯合层析柱纯化后获得纯化的N 肠杆菌DH5a，表达重组TGEV 蛋白。对纯化条件进行优化，得到最佳纯化重组TGEV N蛋白的方法pf将大肠杆菌DH5a 菌体沉淀物经裂解液(含有Immol／L Bradford法测定蛋白质含量为154．7；lg／m1．4797l_tg／ml，推算每克大肠杆菌菌体沉淀物可获 得纯化重组TGEV N蛋白1．52rag。／o 以重组TGEVN蛋白作为诊断抗原建立了两种检测抗体的诊断方法。I在Dot．ELISA中 其抗原最适包被量为1．25p∥点，抗原预点膜4C可保存5周以上，特异性实验表明其与猪 轮状病毒、猪流行性腹泻病毒等肠道腹泻性病毒均无交叉反应。在间接ELISA中，最佳抗 原包被量为O5l岭／孔，封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST，待检血清最适稀释倍数为200 倍，作用时间为30min，底物液最佳作用时间为10min。y 以纯化的重组TGEV N蛋白免疫BALB／c小鼠制备诊断用单克隆抗体。『按常规方法进 行细胞融合，用间接ELISA方法进行筛选，采用有限稀释法，经过3次克隆筛选，最终获 均为阳性。证明制各的单克隆抗体可以识别天然TGEVN蛋白的某一抗原表位。优化了裂 解肠内容物中TGEV的方法。为建立诊断TGEV抗原的检测方法奠定了物质基础≯衫 本研究首次在国内建立以重组TGEVN蛋白为抗原检测TGEV抗体的两种检测方法： DOT—ELISA和间接ELISA：制备了一株抗TGEV N蛋白的杂交瘤细胞系。为TGEV的疫 情监测、及时而准确的诊断奠定物质基础。 | 工． i 关键词crGEv3…重组N蛋白：ELISA；单克隆抗体；抉速—6 V 一。，，，，一一。：，—耋!!些查兰鐾些兰坚耋一。一。。。，：一。．，一。 AND THEDETECTl0NREAGENTS FOR PREPARATl0N RAPIDDIAGNOSIS M匝THODSFOR OFTHE DEVELOPM哐NT INTRANSMISSIBLEGASTROENTERITIS ABSTRACT EcoliDH5a recombinant wasinducedwithIPTGto harbouring plasmidpProExHTb-N therecombinant virus(TGEV)．The express nucleoprotein(rNP)oftransmissiblegastroenteritis rNPcollectedaftereelIextractionwas ontothenickeInitrilo-tri-aceticacid(Ni，NTA) applied resinThe of was theE．colt Buffer purificationlysing by A(containing optimizedprocedure theresinwith 1mmol／L 2XBu行er