猪肝细胞的分离培养和AMPK活性调控的分析.pdfVIP

猪肝细胞的分离培养和AMPK活性调控的研究 摘要 本试验在简化细胞培养方法的基础上，研究激活剂5一氨基-4-咪唑羧基酰氨核苷 肝细胞的分离采用二步胶原酶灌注法，细胞进行悬浮培养，简化之处是在培养过程不 f 脱氢酶(LDH)、尿素(BU)和细胞AMPK的活性。结果表明： 本试验采用的猪肝细胞分离方法，能分离得到较多的猪肝细胞，并保证细胞有较 好的结构功能完整性，简化的培养操作能在180min内维持细胞较高的活性，可用于 AMPK的研究： 细胞AMPK活性升高分别为8．1 9．13％、22．39％。 肝细胞AMPK的活性。 关键词 猪 肝细胞 AMPK活性 注：本研究为国家自然科学基金资助项目“肝细胞AMPK与脂肪代谢及应激对I$IPK活性的影响研 究”(编号的部分内容。 前言 在现代养殖生产中，畜禽时常遭受来自环境、营养与饲养技术、生理和疾病等各 种应澈，导致采食量和生产性能下降，产生代谢性疾病，甚至死亡。尽管长期以来人 们对动物应激进行了大量研究，但其机理仍不清楚，且尚无克服应激危害有的效措施。 从营养角度看，应激必然影响营养代谢，一切应激症状均是营养代谢过程改变的结果。 但应激如何影响营养代谢，如何通过营养管理来克服或缓解应激的不良影响，目前仍 知之甚少。 protein kinase：腺苷一磷酸激活的蛋白激酶)在能量代谢调节中起着重要作用。其主要生化 功能是根据机体的能量状态调节产能和耗能(ATP的生成与消耗)代谢。由于应激增 和碳水化合物代谢朝着促进ATP生成、抑制ATP消耗的过程进行，使细胞能量水平 得以恢复正常。 目前．关于AMPK的研究主要限于实验动物(如大鼠、兔)，对高等生物猪禽的 AMPK的研究很少。而现代养殖生产中，猪禽面临的应激很多、程度也很大，急待 寻找有效的解决办法。用实验动物获得的AMPK研究成果为研究猪禽生产中的应激 问题提供了新的方向，如果证实AMPK参与猪禽的应激代谢，就有可能通过调节 系。本研究拟采用细胞培养技术考察激活剂和抑制剂对猪肝细胞AMPK活性的影响， 为迸一步开展AMPK与应激和脂类代谢关系研究奠定基础。 l文献综述 1．1 AMPK豹发现 973)报道，将大鼠肝 AMPK的研究最早始于二十世纪七十年代初期。Beg等(1 微粒体制备液与Mg-ATP和细胞质液成分培养，随着时间的延长，羟甲基戊二酸单酰 辅酶A还原酶(HMGR)的活性逐渐受到抑制，用人的成纤维细胞培养也观察到同 et et a1．1978：Koth 样现象。此后发现HMGR的失活与其发生的磷酸化作用有关(Beg 2 et 酸化失活作用(Ferrer Kinase．3：乙酰辅酶A羧化酶激 蛋白激酶，命名为ACK．3(Acetyl．CoA Carboxylase 的调节。以后研究证实引起ACC和HMGR失活的激酶为同一种酶，重新被命名为 etal，1989)。 AMPK(Carling 1．2 AMPK的生化特征 1．2．1分子结构 et 体，其中d亚基为催化亚基，B和y为调节亚基(Daviesal，1994)。a亚基的氮端 14C．FSBA与d亚基的别构位点结合。在网织红细胞溶解物表达和免疫沉淀发现，d