甘薯[Ipomoea batatas L.(Lam.)]脱毒和离体遗传转化体系的优化与应用分析.pdfVIP

塑堕塑堇查堂堡生堂竺堡苎 片薯脱毒和离体遗传转化体系的优化与应用研究 batatas 甘薯{IpomoeaL．(Lain．)l脱毒和 离体遗传转化体系的优化与应用研究 学科专业 植物学 研究方向 植物分子生物学 指导教师 高 峰 教授 研究生 陈永文(99190) 内容摘要 batatas 甘薯[，pomoegl L(Lam．)]是一种重要的粮食作物。目前发现病毒病害造成 了其种质的退化，病毒病已成为甘薯产量进～步提高的限制因素。f通过茎尖培养获得脱 毒种苗是防治甘薯病毒病害和减缓种质退化的最为有效的措施。80车代以来，品质改良 已经成为甘薯最主要的育种目标，特别是蛋白质含量的提高及氨基酸组成的改善已成为 甘薯品质改良的主攻方向。弃一’ 本文对影响甘薯脱毒的各种要素进行研究，并比较各种病毒检测技术的有效性与灵 敏性。分析各种因素对根癌农杆菌介导的甘薯离体遗传转化的影响，优化甘薯离体遗传 转化系统。将甘薯块根蛋自基因启动子(sporamin Zcin 溶蛋白基因(10kD 因的器官表达水平及产物积累方式，探讨甘薯块根蛋白基因启动子(Psp)的调控模式。 并对转基因甘薯的主要农艺性状进行评价，分析外源基因对甘薯内源基因表达的影响。 ／现将工作和结果报道如下： 、1甘薯良种脱毒种苗繁育体系的建立 利扇茎尖培养技术，研究了不同的茎尖来源、激素种类的配比及甘薯的基因型等对 成茁率的影响。试验结果表明，茎尖的分裂和分化能力可影响成苗率。薯块萌芽的茎尖 较试管苗和大田苗的茎尖具有更强的分裂和分化能力，易于培养成苗，其成苗率最高， 达到53．2％。培养基中激素的配比对成苗率影响显著。NAA、6-BA可提高甘薯茎尖成苗 成苗率有一定的影响，品种“南瑞苕”和“渝苏303”成苗率最高，分别为18．0％和1z．0％， 而“南薯88”和“岩薯5号”较低，仅为4．4％和2．0％。采用症状学法、指示植物法、 测结果表明，目前危害重庆市甘薯的病毒主要是甘薯羽状驳斑病毒(SPFMV)和甘薯浅隐 病毒(SPLV)。脱毒与带毒试管苗的生长状况分析表明，病毒可阻碍甘薯植株的正常生 长，尤其对植株高度、茎分节数及叶柄长度影响最大，脱毒植株比带毒植株高度平均高 出63，】6％。 西南师范大学硕士学位论史 甘薯脱毒和离体遗传转化体系的优化与应用研究 2甘薯离体遗传转化系统优化的研究 NPT—II基因)。试验卡那霉素(Kan)和头孢唑林钠(Cefazolin Sodium，Cef)对甘薯茎段外 植体不定根和不定芽分化的影响。分析菌液浓度、感染时间、预培养、共培养时问、a一 介导的遗传转化的影响，优化甘薯离体遗传转化系统。 试验结果表明，Kan可影响茎段外植体不定芽的分化，当Kan浓度大于80mgL‘时， 外植体不定芽的分化受到明显的抑制，因此，以80mgL。Kan浓度作为抗性芽分化的选 择压。抗生素Cef可影响农杆菌的繁殖和茎段外植体不定芽的分化。当cef5浓度为500 mgL。时，可有效地抑制农杆菌的繁殖但不影响外植体不定芽的分化。因此，本研究将 甘薯离体遗传转化的Cef抑菌浓度确定为500 mgL～。 外植体分化出非转化的不定芽，3次继代筛选后大多数不定芽死亡。当菌液浓度过高时 过旺，以至掩埋整个外植体，最终导致外植体褐化坏死。菌液浓度为0D600=0．4，浸染时 I训为4min为甘薯较适宜的感染浓度和浸染时间。 预培养和共培养时间对甘薯KaW芽的获得率也有影响。预培养时间短，筛选后获得 的Kan’芽的频率很低。预培养时间太长(5～7d)，在预培养阶段，茎段外植体切口处的 细胞可分化出大量的不定芽，这将不利于随后的根癌农杆菌的侵染和Kan7芽的获得。只 有预培养时间为3d后感染根癌农杆菌，3次筛选后其Kan‘芽的获得率达到最大值，为