生存素基因突变体诱导胃癌细胞凋亡的实验分析.pdfVIP

生存素基因突变体诱导胃癌细胞凋亡和有丝分裂危象的实验研究 中文摘要 目的 生存素(survivin)基因在胃癌组织中具有高水平表达，而在 正常胃粘膜中没有表达。生存索表达的水平与胃癌的预后密切相关。 株，观察其对胃癌细胞的生物学特性及多药耐药性的影响。方法本 研究应用基因工程技术重组构建生存素基因及其突变体(Cys84Ala) 应用RT．PCR、wegemblot、免疫组化等方法检测胃癌细胞中生存素 色素C释放水平的变化；流式细胞仪和吖啶橙染色检测胃癌细胞凋 亡，免疫荧光检测有丝分裂危象。结果经基因测序验证重组构建生 存素基因和生存素基因突变体成功。通过免疫组化检测显示在30例 不同分化程度的胃癌组织中，有25例存在生存素阳性表达(83．3％)， 有5例生存素阴性表达，与正常胃粘膜组织中一样。在不同分化程度 的胃癌组织中，生存素表达程度也有所不同，其中低分化腺癌100％ 阳性表达，中分化腺癌83_3％表达，而高分化腺癌表达最低，为62．5 24小时后，随着时间 pcDNA3空质粒对照组相比较，转染Cys84Ala 的延长，胃癌细胞存活数量逐渐减少，凋亡细胞百分比和剂量和时间 癌细胞MKN．45和BCG．823在荧光显微镜下呈现出显著的凋亡细胞 形态，细胞质和细胞核萎缩，染色质浓缩和片段化形态。流式细胞仪 24．48小时的胃癌细胞中，出现较为明显的“亚二倍体“凋亡峰，并 且位于G2／M期的细胞数量明显增加，而S期的细胞数量明显下降。 素基因表达明显增强。Western 细胞中的生存素蛋白表达水平增加。因此，过度表达的Cys84Ala蛋 白可能通过干扰野生型生存素的功能，从而诱导胃癌细胞发生凋亡。 Cys84Ala通过抑制野生型生存素基因的功能诱导胃癌细胞凋亡，增 后，联合HCPT和As203治疗，胃癌细胞凋亡率增加2．3倍以上。当 质粒转染联合顺铂或5．Fu治疗时，也得到类似的结果。因此，Cys84Ala 转染可以明显增加胃癌细胞对化疗药物的敏感性。转染Cys84Ala质 粒后，我们通过免疫荧光检测发现胃癌细胞中有异常细胞核出现。将 许多细胞核异常表现，如多个细胞核、分叶状细胞核和巨型细胞核等。 转染Cys84Ala质粒后，由于细胞动力学障碍导致染色体分离不完全 即退出有丝分裂过程，故有染色体桥联等异常染色体形成。而且，抑 制生存素基因功能也导致胃癌细胞发生有丝分裂障碍而死亡。用广谱 lI 但并不能减少异常细胞核形态的产生，故抑制生存素基因引起的有丝 分裂危象可能与细胞凋亡的发生无关。结论我们在体外试验中证实 了应用Cys84Ala抑制生存素基因表达可以诱导胃癌细胞发生凋亡和 有丝分裂危象，并增加胃癌细胞对化疗药物的敏感性，为将来以生存 素作为靶基因进一步研究胃癌治疗的新的方法提供了一种可能的选 择。Cys84Ala有可能成为胃癌治疗的一个候选基因。 关键词：生存素突变体细胞凋亡有丝分裂危象 Ill Survivinmutantinduces andmitotic in catastrophe apoptosis gastric celllines cancer ABSTRACT is in cancerbutnot Survivin gastric objective overexpressed expressed in of