EMSA原理流程.docx

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。实验方法原理凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。试剂、试剂盒[γ-32P]ATPT4多聚核苷酸激酶Nuclease-Free WaterT4多聚核苷酸激酶缓冲液醋酸铵TE无水乙醇TBE buffer重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过硫酸铵TEMED（四甲基乙二胺）EMSA Gel-Shift结合缓冲液溴酚蓝仪器、耗材水浴锅PCR仪离心机电泳仪电泳槽实验步骤一、探针的标记?1. ? 如下设置探针标记的反应体系：?（1）待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。?（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。?（3）Nuclease-Free Water ：5微升。?（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。?（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。?（6）总体积 10微升?（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。?2. ? 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。?3. ? 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。?4. ? 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。?5. ?标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。?二、探针的纯化?通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：?1. ?对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。?2. ? 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。?3. ?在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。?4. ? 在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。?5. ? 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。?三、EMSA 胶的配制?1. ? 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。?2. ? 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。?（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。?重蒸水 16.2毫升。?（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。?（3）80% 甘油： 625微升。?（4）10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150微升。?（5）TEMED ：10微升?3. ?按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理