化妆品中克雷伯氏菌的检测方法 - 检验检疫标准管理信息系统.doc

出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法 计划编号：2009B136 编 制 说 明 项目承担单位：中国检验检疫科学研究院 项目负责人：赵贵明 项目起止时间：2010.1-2010.10 二〇一〇年十月 《出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法》 编制说明 1.任务来源 本部分为国家质量监督检验检疫部门下达的2010年度制标任务计划，计划编号为2009B136。 2. 标准制订的工作过程 ①标准的申报；②资料查询整理；③制定工作计划；④标准方法的验证；⑤按照GB/T1.1-2000进行标准和编制说明的起草并送专家征求意见；⑥总结反馈信息和意见对标准进行改进；⑦整理资料申报有关部门审定。 3.完成单位： 中国检验检疫科学研究院、珠海出入境检验检疫局、陕西出入境检验检疫局、吉林省产品质量监督检验院、北京奥博星生物技术有限公司。 4.标准起草人： 近几年，我国果蔬汁出口贸易稳步上升，2006-2007榨季，中国浓缩苹果汁出口量就达到104万吨，占到国际市场贸易总量的67%，成为我国食品工业中发展最快的行业之一，预计到2010年用于果汁加工的水果总量将达到2482万吨，而腐败微生物是既农残之后成为影响果蔬汁产品质量及国际贸易的主要因素。 在果蔬汁生产过程中，从原料到产品要经过选果-清洗-压榨-酶解-超滤-脱色-浓缩（杀菌）环节，由于原料、环境、空气中存在环脂芽孢杆菌及其芽孢，不可避免将芽孢带入成品中，即使在酸性条件下经过巴氏杀菌仍不能将其灭活，产品放置一段时间后，芽孢萌发，在代谢过程中产生愈创木酚和2,6- 二溴苯酚，有类似“草药味”或“防腐剂”的不爽味道, 1×10-12 的含量就能造成果汁风味败坏并产生轻微沉淀。为此，从1999年，美国等进口国要求浓缩果汁中嗜酸耐热菌小于1个／10ml(g)；2001年欧洲大部分果汁消费国也提出相同指标要求，而到2002年后，对50ml浓缩果汁中嗜酸耐热菌不得检出几乎成为常规指标，目前阳性样品的比例约为2％，其比例已高于其他食品中的病原微生物。 导致果蔬汁腐败的微生物，细胞膜含有共同的ω-环状脂肪酸，1992年Wisotzkey等人根据16SrDNA基因序列分析结果，将它们从芽孢杆菌属(Bacillus)中划分出来，成立一新属，命名为环状脂肪酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)，简称为环脂芽孢杆菌，该属菌目前包括8个种、2个亚种。由于目前企业缺乏快速、有效的检测和监控手段，使得产品流通到消费者手中腐败才会被发现，成为浓缩果汁生产厂家最为棘手的问题。 目前已有果汁中检测环脂酸芽孢杆菌的方法，如日本果汁协会耐酸耐热菌统一检测方法、美国库克实验室耐热耐酸菌的检测方法、日本NDM公司耐热耐酸菌的检测方法、美国雀巢公司耐热耐酸菌检测方法等，但国内外没有标准方法，不同实验室采用不同检测方法，常使检测结果存在差异，直接影响了我国果蔬汁的出口贸易。因此，制订检验标准，将大力推进产业发展，保障我国果蔬汁出口贸易顺利进行。 本标准共分为二个部分，第1部分“分离与计数方法”的内容参照国际果汁生产商联合会（International Federation of Fruit Juice Producters,IFU）颁布的“导致果汁变质的果汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法”（Method on the Detection of Taint Producing Alicyclobacillus in Fruit Juice）2007版进行实践研究，并通过试验和验证后制订。第2部分“荧光PCR方法”为快速筛选方法，参考文献“Development of a real-time PCR-based system targeting the 16SrRNA gene sequence for rapid detection of Alicyclobacillus spp. in juice products”（International Journal of Food Microbiology 99 (2005) 229– 235），并通过试验和验证后制订。 第1部分 分离与计数方法 本部分采用的样品处理方法、增菌方法、分离培养基及可疑菌落鉴定方法研究如下： 1.1 培养基及试剂 1.1.1 K琼脂 成分： 酵母提取物 2.5 g 蛋白胨 5.0 g 葡萄糖 1.0 g 吐温 80 1.0 g 琼脂 15.0 g 制法：将上述成分混合，加入1 L去离子水。121 ℃高压灭菌15 min。冷却至50 ℃，用25%苹果酸调节pH值至3