综合性试验 蛋白质的分离提取SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Westen印迹.PPT

蛋白电泳及印迹技术（二）  蛋白质印迹分析技术(Western Blotting) 一、目的与要求 应用蛋白质印迹分析技术，分析经SDS电泳分离并转移到硝酸纤维素薄膜上的细胞特定蛋白成分。 二、实验原理 经SDS分离后的蛋白质样品，通过电转移固定在固相支持物（如：硝酸纤维素薄膜）上，固相支持物以非共价键形式吸附蛋白质。 以固相支持物上的蛋白质作为抗原，与相应的抗体，即第一抗体起免疫反应，再与酶、同位素或其它标记物标记的以第一抗体为抗原的第二抗体起反应，采用底物显色或放射自显影等方法即可观察分析电泳分离的特异蛋白质成分。 标记的二抗 一抗 蛋白 膜 免疫印迹实验包括5个步骤： 1、固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS- PAGE），并从胶上转移到硝酸纤维素（Nitrocellulose，简称NC）簿膜上。 2、封闭：用牛血清白蛋白或脱脂奶粉封闭膜，主要目的是为了减少特异抗体对膜上其它部位的非特异性吸附。 3、第一抗体结合：特异性识别和结合抗原蛋白质。 4、第二抗体结合：对于第一抗体是特异性的并作为指示物。 5、被适当保温后的酶标记蛋白质条带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。 Western blot 三、操作步骤 1. 按照SDS要求，对样品蛋白质进行电泳分离。（第一部分已完成） 2. 转膜：从玻璃板内取出凝胶，将凝胶在电转移缓冲液浸泡一下（先把Whatman 3MM滤纸及硝酸纤维素薄膜在电转移缓冲液浸泡10分钟），按照下图所示夹心方法把Whatman 3MM滤纸、凝胶、硝酸纤维素薄膜、石墨板依顺序放好，操作时注意驱赶气泡。电转移条件为常温1Am/cm2 恒流约1.5 hr。 15层滤纸 凝胶 15层滤纸 NC膜 石墨板 石墨板  戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，防止手上的油脂阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致。 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极。 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活选择。 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率。 膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置。已用预染标准蛋白质marker省略。 2. 转膜步骤 3. 封闭 用5％脱脂奶粉或3％BSA（含0.1％Tween20 TBS或PBS配制）。 时间：室温2h或4oC过夜。 4. 免疫学检测 将硝酸纤维素薄膜与用封闭缓冲液适当稀释的第一抗体37℃反应约0.5 hr或4 ℃反应过夜，其间不停地在摇床上晃动。 将硝酸纤维素薄膜在清洗缓冲液中晃动清洗30分钟，每5 min换一次清洗缓冲液。 取出膜，将硝酸纤维素薄膜与用封闭缓冲液适当稀释的酶标记第二抗体37℃反应约0.5 hr，或RT 1-2hr, 其间不停地在摇床上晃动。 用pH6.8 的50mM Tris-HCl 清洗3次。 根据二抗的标记形式选择相应的显色或显影系统对膜上的蛋白质进行显色或显影。保存硝酸纤维素薄膜或拍照作记录。 显色或显影 显色 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定。  化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的? －2ME ）洗涤后，再次经BSA或脱脂奶粉溶液进行封闭，再用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。 碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交。 5 膜的再利用 四、结果 如果所检测特异性蛋白存在，则会在相应的位置上出现相应条带。 五、应用意义 Western blotting是用于分离蛋白质的一种成熟的方法，它广泛应用于蛋白质特征和结构的研究。 是非题： 采用醋酸纤维素薄膜或NC膜进行转膜时，转膜液的配制是有区别的。 正确 Western blot 转膜时，膜在阴极，凝胶在阳极。 错误 Western blot实验结束后，使用的任何膜都是可以重复使用的。 错误 单选题： Wester blot时，37℃孵育一抗杂交时，敏感性会提高，同时会增高的有： （A）特异性（B）非特异性（C)可靠性 （D）独特性 答案 B 2. WB实验中，如果将要使用生物素标记的二抗