刀槽及液面的调节.DOC

（4）刀槽及液面的调节 超薄切片只有漂浮在水面上或其他合适的液面上才便于收集、伸展和捞取，为此在刀口背部装上一个小的水容器，通常称为“刀槽”。通常用定制的硬塑料刀槽架或用一小段医用橡皮胶缠绕过刀背，紧紧地粘在玻璃上，橡皮胶的后下部分用融化的牙科用红腊密封，以防漏水。注意橡皮胶的顶端不应高出刀刃。切片前在刀槽内加入双蒸水，使切后的切片漂浮于液面上。液面的调节一般先加稍过量的液体使之凸起，以保证浸湿刀刃。然后在双筒解剖镜下用注射器或移液管慢慢吸去一部分液体，调整照明系统，当液面变成凹面、可见一反射光线的弧面，即为正确的液面。从这一光亮的反射光可看到切出的片子。在切片过程中由于液体蒸发，需加液以保证正确的液面。 （5）超薄切片 切片时将夹着修好组织块的样品夹安装在切片机的样品臂上，刀台上装好玻璃刀，其高度要与刀台上的标准规等高，后斜角一般在3～5°，在显微镜下使样品块面的上下两条平行边与刀刃平行，如是梯形的应长边在下面。调整好刀刃和组织块的距离，再在刀槽内注入适量的双蒸馏水。将切速放在2～5mm／秒，调节控制切片厚度的电流表，即可切片。当切片停止时，立即打开电吹风，冷却样品臂。捞片后关掉电吹风又可重新切片，或更换新刀。 切片厚度的判断。一般是利用反射光干涉色来判断切片的厚度，即从切片表面反射的光和从切片下面的水面的反射光发生干涉现象（见下表）。当用白光时，从双筒显微镜下观察两种光线间的差别。 目前公认的树脂包埋切片厚度与干涉色的近似值 干涉色 切片厚度 暗灰色 40nm以下 灰色 40～50nm 银白色 50～70nm 金黄色 70～90nm 紫色 90nm以上 ,並將要觀察的部份露出。習慣上將樣品塊修整成平頂的金字塔型 (從側面觀察)，頂部與底部略成梯形 (從上方觀察)，大小應小於0.5 mm，金字塔高度不宜超過0.2 mm。 將樣品塊修整成平頂的金字塔型，是為了讓樣品在切片過程中得到最佳的支持力。高度過大，切片時容易發生震動，在切片上留下深淺交替的平行條紋，或導致樣品塊前端斷裂。 較小的樣品塊切面較容易進行超薄切片，但過小的切片在電子顯微鏡下可觀察到的東西較少。 方法步驟： 1) 將樣品塊放置在解剖顯微鏡下，以刀片 (two-edged razor blade) 水平的削去尖端直到組織露出 (圖1.4.1, 步驟1)。 2) 修出梯形的上下底。先將刀片以垂直方向切下，再將刀鋒以水平朝向自己的方式緩慢前進，至前一刀垂直切下處即可除去不要的部份 (圖1.4.1, 步驟2-3)。 注意力量的控制。 3) 修出梯形的兩邊，方式同上 (圖1.4.1, 步驟4-5)。 4) 待初步形狀出來後，換一新刀片再做更細微的修整，盡量使上下底平行，切面光滑無缺刻。 此步驟會影響連續切片 (ribbon) 的形成。 圖1.4.1 樣品塊修整 (圖片取自Methods of Preparation for Electron Microscopy, An Introduction for the Biomedical Sciences) 1.5 玻璃刀 (glass knife) 與刀口水槽 (trough) 製作 玻璃刀需於切片當天製作，請於切片當天預留0.5-1 h。 方法步驟： 首先取一乾淨的玻璃條，粗造面朝下 (由玻璃條側面觀之)。利用製刀機將玻璃條 (glass strip) 切割成一英吋大小的正方形，再由對角線 (約略偏斜) 切割一裂痕，自兩側及底部加壓使玻璃斷裂為二即成。理想的刀口應呈現平整均勻，在解剖顯微鏡下無鋸齒狀缺刻 (圖1.5.1)。 施加壓力於經鑽石刀劃過的玻璃條時，需慢慢的添加壓力。當切口出現一半月型的陰影或白影 (視觀察角度而定) 時，即停止繼續增加壓力，使切口自行持續擴大至斷裂。經此過程做出的玻璃刀有較佳的品質。 圖1.5.1 玻璃刀的製作 (A) LKB700製刀機。(B) 利用製刀機上的鑽石刀在玻璃條上略做切割。(C) 旋轉製刀機右側旋鈕，自玻璃條兩側及下方均勻施加壓力，使其斷裂。(D) 及 (E) 每一正方形玻璃條可製作2把玻璃刀，每把刀各自有刀鋒及刀座。第一把刀的刀鋒恰好緊鄰第二把刀的刀座。 (F) 製作完成的玻璃刀可以在顯微鏡下檢查刀鋒部分，理想的刀鋒應為平滑無缺刻。整把刀最適合切片的部分為Z區，約佔1/3；S區不用於切片；而E區的使用需視刀鋒的品質而定。 (圖片A-C, E取自生物電子顯微鏡學, 圖片D, F取自Methods of Preparation for Electron Microscopy, An Introduction for the Biomedical Sciences) 將銀膠帶的一端貼於刀口下方並與底部平行後，另一端圍繞成一平滑的弧形貼於另一側，圈出一船型水槽。過程中