miRNA 产品使用说明.PDF

miRNA 产品使用说明 RN: R10034.8 产品简介 micrON™ miRNA mimic 是 miRNA 模拟物 ，化学合成的成熟 miRNA 双链 ，即用型； micrOFF™ miRNA inhibitor 是 miRNA 抑制物 ，化学修饰的成熟 miRNA 互补单链 ，即用型 ； micrON™ miRNA agomir 是特殊化学修饰的 miRNA 激劢剂 ，适用于细胞实验、劢物实验 ，即用型； micrOFF™ miRNA antagomir 是特殊化学修饰的 miRNA 拮抗剂 ，适用于细胞实验、劢物实验 ，即用型。 运输保存 产品以冻干粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。使用前瞬时离心， 用 RNase-free H O 或灭菌 ddH O ，配制成 20μM储存液 ，分装保存，避免反复冻融 （不超过 5 次 ）。 2 2 表 1 20μM 储存液的配置参考 miRNA 5 nmol 20 nmol 溶解体积 250 μl 1000 μl 注：如需进行高内涵筛选试验，可选择 miRNA mimic library 或 miRNA inhibitor library。 使用前须知 产品以冻干粉的形式提供，由于影响结晶形态的因素很多，产品外观有些差异，甚至形态无法用肉眼可见。此为正常现象。 为避免外界因素 （包括酶，极端 pH 或者温度条件等 ）导致产品降解，所有操作请严格遵循 RNA 操作觃则。实验过程 中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。 细胞实验方法： 为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议： 1 ）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔； 2 ）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。 1. 转染浓度 miRNA 产品最佳工作浓度因丌同的细胞类型及研究目的而异。锐博生物推荐的 miRNA mimic 初始浓度为50nM ，miRNA inhibitor 浓度为 100nM ，客户可根据实验具体情况优化转染浓度 ，优化的范围建议为 10~200nM。 注：miRNA inhibitor 往往需要用到较大的用量才能观察到较好的抑制效果，相当于 miRNA mimic 的几倍用量，这可能不miRNA inhibitor 竞争性抑制的作用 机制及作用效率有关。因此，当使用推荐的转染浓度没有获得预期效果时 ，可适当选择更高的浓度或选择 antagomir 进行实验。 2. 转染方法 以riboFECT™ CP Reagent 转染miRNA mimic于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他觃格容器的试剂用量请参考表2 ， 若使用其它转染试剂，请参考对应转染试剂说明书。 1 ）接种细胞 5 5 a. 贴壁细胞 ：以Hela细胞为例，接种1×10 ~5×10 个细胞至含有适量完全培养基的24孔板培养孔中，使转染时的细胞密度 能够达到30~50%。 5 5 b. 悬浮细胞：以THP1细胞为例，接种1×10 ~5×10 个细胞至含有适量完全培养基的24孔板培养孔中。 1 / 4 注：1 ）丌同细胞生长速度丌同 ，接种数量及密度需依据细胞类型，培养时间，实验目的而定 ；2 ）每孔接种的细胞数量应尽量相同，使细胞均匀分布。 2 ）转染 对于每个转染样品，请按以下步骤准备： a. 稀释 mimic ：用 30μl 1X riboFECT™