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第十九章 基因工程导论 本章学时数：3-4学时 本章重点：1.基因工程原理和方法 2.转基因技术及应用 遗传工程 广义的遗传工程 指的是用遗传学手段来改造或重组生物的遗传特性的技术，包括杂交、细胞工程、染色体工程、蛋白质工程和基因工程等。 狭义的遗传工程 仅指基因工程。 基因工程 Gene engineering 指用类似工程设计的方法，人为地在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其他载体中，构成遗传物质的新组合，并将它转移到原先没有这类分子的寄主细胞中扩增和表达。 DNA重组技术是基因工程的基础。 重组DNA技术 Recombinant DNA technology,1972年，Berg发明。 定义：指在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组，形成嵌合DNA分子，通过载体系统，将之导入宿主细胞，使其扩增表达从而使宿主细胞获得新的遗传性状。 步骤：1. 分离制备目的基因或特定的DNA片段 2. 目的基因与载体连接，构建重组DNA分子 3.重组DNA分子引入宿主并扩增表达。 基因工程的基本内容和技术 基因工程的核心技术是分子克隆 主要内容： 从复杂生物体基因组中，分离带有目的基因的DNA片段或用化学方法合成基因。 将目的DNA片段与能够自我复制并具有选择标记的载体分子在体外连接，形成重组DNA分子 将重组的DNA分子引入到适宜的受体细胞中进行扩增 从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定，以获得重组DNA分子的受体细胞的克隆 从所筛选的受体细胞克隆提取已扩增的目的基因后，或再将其克隆到表达载体上，导入寄主细胞，以便在新的背景下实现功能表达，生产人们所需的物质，或将已扩增的目的基因作进一步的分析研究。 基因工程的基本技术 核酸研究技术 核酸提取技术 核酸鉴定技术 核酸测序技术 核酸人工合成技术等 培养技术 微生物培养技术 动植物细胞培养技术 转化技术 筛选技术等等 限制性核酸内切酶 限制性内切核酸酶restriction endonuclease，简称限制酶restriction enzyme 可识别DNA链的特定碱基顺序并在特定位置将DNA链切断，形成平切或错切端口的水解酶。 限制酶的命名规则： 通常用细菌学名（属名和种名）、菌株名、特征和发现的顺序缩写表示。如EcoRI是从含R质粒的大肠杆菌中分离的第一个限制性内切酶。 三类限制酶的主要特性 II型限制酶的基本性质 ?R=A 或 G? ?????Y=C 或 T? M=A 或 C ?K=G 或 T? ?? ??S=C 或 G? ? W=A 或 T ?H=A 或 C 或 T? ?? ? B=C 或 G 或 T? ?? ?? ?? ?V=A 或 C 或 G? D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T  修饰酶 修饰酶 内切酶对自身的DNA也有可能的破坏。 修饰酶识别特定的顺序并将其甲基化，保护不被限制性内切酶作用。 DNA的限制酶分析和物理图谱 DNA连接酶 DNA连接酶(ligase)是一种能够催化DNA中相邻的3’－OH和5’－磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的核酸酶。 连接酶催化反应的最适温度是37℃。 连接酶把两个具有粘性末端的DNA分子连接在一起的方式称作“粘接”，而使平末端的双链DNA分子彼此连接的方式则称为“端接”。连接酶也用于连接化学合成的衔接物(linker)，这有助于体外合成人造基因。 反转录酶 反转录酶（reverse transcriptase,RT）是一类很独特的DNA聚合酶，以RNA为模板来指导DNA的合成。 1970年首先在RNA病毒中发现，由反转录病毒的pol基因编码。 现在常用的反转录酶由?和?两条多肽链组成， ?肽链的羧基端具有反转录酶活性，而氨基端有RNaseH活性； ?肽链具有以RNA-DNA杂种分子为底物的5‘?3’脱氧核酸外切酶活性。 反转录酶的应用 以mRNA为模板合成cDNA 克隆基因 制备探针 目的基因的分离或制备 人工合成目的基因 当RNA的碱基顺序或蛋白质的氨基酸顺序已知时，用特定的仪器进行合成。 目的基因分离 富含G/C对的基因 加热后用SI核酸酶切除单链，离心得到双链片段。 易得到mRNA的基因 用polyT柱分离mRNA，在反转录酶作用下合成cDNA，除去RNA，用DNA聚合酶下合成双链。 并非严格意义上的基因。 PCR扩增 进化中DNA保守性很强，不同生物同一功能基因的顺序大部分相同，设计引物PCR扩增。 目的基因的获得 PCR扩增获得目的基因 /sites/entrez?db=Nucleotide 载体 vector 分子克隆的载体应具备的条件： 在细菌中增殖，可以在菌株间传递，也可以转化菌株。