中国医科大学研究生选修课—细胞生物学实验技术.pptVIP

激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台 上下移动,改变焦平面 得不同层次的切面图像 计算机图像三维重组获样品立体图像 透射电镜的成像原理 电子束通过标本时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只有剩余的电子成像，经物镜和投射镜放大后投射到照相底片或荧屏上。 由于散射的电子不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流量减少的暗区；相反密度小的部分散射电子少而形成明区。 扫描电镜的成像原理 阴极钨丝加热后产生的电子束经过栅极和阳极加速和会聚，再经二级聚光镜及物镜会聚形成具有一定能量、一定束流强度和束斑直径的微细电子束； 电子束在扫描线圈驱动下，在试样表面按一定时间、空间顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用，产生二次电子发射。二次电子发射量随试样表面形貌而变化； 二次电子信号被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。 优点 * 样品不经固定、脱水、包埋，更接近自然状态 * 对样品无损伤 * 研究膜分子结构的唯一显示方法 * 可获得立体结构图象 X射线衍射技术（x-ray diffraction） 核磁共振技术（NMR） 特点：测定蛋白质的液相空间结构。 　　 功能：保持原分化特性 　　形态：多不保持原有细胞形态 成纤维样细胞 上皮样细胞 （２）由癌细胞建立的“癌细胞系” 特点:可在培养皿中以极高的密度增殖， 没有扩展的余地时,可向空间生长。 Hela人宫颈癌细胞 （３）正常细胞经诱导建立的“转化细胞系” 肿瘤病毒 放射线 化学致癌物 用癌基因转染正常细胞 4.细胞克隆（Cell cloning） 克隆（clone）：指由同一个祖先细胞通过有 丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 4. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 抗体＋酶 5.细胞融合（Cell fusion） （1）定义 在自然或人工条件下，使二个或二个以上 细胞合并形成一个细胞的过程。 异核体 杂交细胞 分裂 （2）促融方法 生物学方法：仙台病毒 化学方法：PEG 物理方法：电脉冲打孔仪 （3）应用 A 细胞核和细胞质 间的相互作用 鸡红细胞 组织培养细胞 融合 红细胞开始合成RNA,并进行DNA复制 B 膜蛋白的流动性 C 基因定位 D 单克隆抗体制备 B淋巴细胞 肿瘤细胞 Mouse cell Human cell division E 细胞周期相关因子的发现 四、细胞组分的分级分离 通过逐级分离对细胞内细胞器和各种成分的 化学性质和功能进行研究的方法。 匀浆、分级分离、分析 （一）离心法 用于分离细胞器和大分子 1.破坏细胞 匀浆液 膜 细胞器 大分子 低渗 超声 去污剂 强制过滤 研磨 细胞 破坏 2.分离组分 (1)差速离心法 分离对象:大小和形状显著不同的组分 （细胞核、细胞器） 具体方法:由低速到高速逐级沉降 (repeat) (2)速度沉降法 分离对象:密度相近而大小、形状略有差异的 组分(沉降系数S) 具体方法: 在离心管中予装5%-20%蔗糖梯度的离心介质 (3)平衡沉降法 分离对象:密度不同的组分（与大小、形状无关） 具体方法：在离心管中予装一定密度梯度的离 心介质（20%-70%蔗糖、CsCl） 介质最低密度大于被分离组分的最大密度。 （二）层析法（柱层析） 主要用于分离、纯化蛋白质 填充柱 填料（固定相） 流动相 1.离子交换层析 层析介质:阴离子或阳离子树脂 分离原理:电荷 2.凝胶过滤层析 层析介质:凝胶 分离原理:分子大小 3.亲和层析