免疫组化步骤要领.docx

免疫组化实验步骤??细胞和组织的固定（一）固定　　为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。　不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大（二）固定剂　　用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。1．醛类固定剂　　双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂2）Bouin’s液该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。2．丙酮及醇类固定剂　　系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。　　丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。　　以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截然不同。选择最佳固定液标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构。②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。　　固定组织时应注意：①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。②组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。④组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。?石蜡组织标本处理过程?????????????????????????????????1．取材：将动物（如大小鼠）断颈处死后迅速取出所要组织，然后裁成大小为(1cm×1cm×0.5cm)剔除组织上的脂肪和钙化，将组织放入PBS缓冲液中洗涤（直至组织上无血渍为止）2．?固定：将组织置于4%多聚甲醛固定液中4℃固定，固定时间和组织厚度成正比（每1mm一小时）3．?脱水：固定后的组织经PBS缓冲液洗涤后（浸泡30分钟×3次）放入乙醇中4度剃度脱水???1)???????? 70%乙醇 4℃ 3～4h??? 2)???????? 80%乙醇 4℃ 3～4h?? 3)???????? 90%乙醇 4℃2～3h??? 4)???????? 95%乙醇Ⅰ 4℃ 2～3h????5)???????? 95%乙醇Ⅱ 4℃ 1～2h??? 6)???????? 100%乙醇Ⅰ 4℃ 1.5h??? 7)???????? 100%乙醇Ⅱ 4℃ 1.5h??? 8)???????? 二甲苯Ⅰ 4℃ 0.5～1h??? 9)???????? 二甲苯Ⅱ 4℃ 0.5１～1h??? 10)????? 石蜡Ⅰ 60℃ 1h?? 11)????? 石蜡Ⅱ 60℃ 2h?　　以上全过程为18-24h，也可在室温内使用自动脱水机代替。如组织块小，直径小于0.5cm，可用快速石蜡包埋切片，全过程只需4h左右。有些组织在切片时易碎（如肝脏），在脱水时可适当缩短脱水时间4浸蜡：将组织浸入液态石蜡中（2小时×2次）严格控制浸蜡温度（60—65℃为宜），防止温度过高导致组织蛋白丢失。5模具包埋：待蜡完全凝固后4℃保存6切片：要求刀片锋利，切片时尽量避免刀痕与皱折，切片投入50℃左右水浴中，若展片困难时可适度加入几滴乙醇，待完全展开后将其黏附在玻片中央。7烤片： 60℃烤片30分钟，或37℃恒温箱过夜..烤完后切片标本可长期保存?免疫组化的试剂准备??????????????????????????????????　　最重要的是选择好一抗、二抗或者还有三抗，注意抗体的特异性、效价和交叉反应。其他常用试剂有：1、0.01M(pH