实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定_百替生物.pdf

实验二十一 质粒DNA 的提取、酶切与鉴定 一、质粒DNA 的提取 [原理] 分离质粒DNA 的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细 菌；分离和纯化质粒DNA 。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA ，是基于染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性 的差异而达到分离目的。在pH 高达12.6 的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺 旋结构解开而变性。质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补 链不会完全分离。当以 pH4.8 的醋酸钾高盐缓冲液去调节其 pH 至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结 构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA 、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下 来而被除去。 [试剂] 1.溶液I ： 50mmol/L 葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml 。 2.溶液II ： 200mmol/L NaOH 、1% SDS。 3.溶液III ： pH4.8 醋酸钾缓冲液 （60 ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml 冰醋酸、28.5ml 蒸馏水） 4.TE 缓冲液 pH8.0 5.含RNaseA 的TE 缓冲液：TE 缓冲液含20 μg/ml RNaseA 。 6.苯酚：氯仿（1：1，v/v ）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数 为0.1%，并用Tris-HCl 缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24 ：1 （v/v ）。 7.1 ×LB 溶液 8.100 μg/ml 氨苄青霉素 [器材] 1.TGL-16 型台式高速离心机 2.1.5ml 塑料离心管 3.离心管架 4.微量移液器 service@100 5.常用玻璃器皿 [操作步骤] 1.培养细菌 将带有质粒pUC19 的大肠杆菌接种于5ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的1×LB 中，37℃培养过夜。 2.取液体培养菌液1.5ml 置塑料离心管中，10 000r/min 离心lmin ，去掉上清液。加入150 μl 溶液I ，充分混匀，在室温下放置10min。 3.加入200 μl 新配制的溶液II ，加盖后温和颠倒5~10 次，使之混匀，冰上放置2min 。 4.加入150 μl 冰冷的溶液III ，加盖后温和颠倒5~10 次，使之混匀，冰上放置10min。 5.用台式高速离心机，10 000r/min 离心5min，将上清液移入干净的离心管中。 6. 向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v ），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min ， 将上清液转移至新的离心管中。 7. 向上清液加5mol/LNaCl 至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2 倍体积无水乙醇，混匀， 室温放置2min ，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。 9.加入50 μl 含RNase A 20 μg/ml 的TE 缓冲液溶解提取物，室温放置30min 以上，使DNA 充分溶解待用或置-20 ℃备用。 二、质粒DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定 [原理] 限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象 中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA 甲基化酶 （修饰作用）。它们对DNA 底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。 Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力，能 在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA 的双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。限 制性内切酶对环状质粒DNA 有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的 片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶 切片段大小的差别。用已知相对分子质量的线状DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较， 可以粗略地测出大分子形状相同的未知DNA 的相对分子质量。 [试剂] 1. EcoR I 酶解反应液（10×）: 1mol/L pH7.5 Tris-HCl