植物分子生物学实验指导.doc

实验一、大肠杆菌质粒DNA提取 一、原理 采用碱变性法抽提质粒DNA用于载体构建、基因分离、目的片段亚克隆、重组体鉴定等分子操作。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在pH大于12的碱性条件下染色体DNA的氢键断裂双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离当以pH 5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时.变性的质粒DNA又恢复到原来的构型保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心染色体DNA与不稳定的大分子RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 二、材料 菌种：E.coli JM109 pUC18质粒(如图)。 LB培养基 蛋白胨 10g 酵母浸出粉 5g 氯化钠 10 g 用950ml蒸馏水溶解用10mol/L NaOH调pH至7.0定容至1000ml分装1×105高压灭菌。 三、试剂 (1)、溶液I ：50mmol/L25mEnol/L Tris·Cl（pH8.0）10mmol/L EDTA(pH8.0)6.90×104pa消毒15分钟4℃贮存。 (2)、溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS。 (3)、溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60ml冰乙酸11.5ml　dH20　28.5m1。配制好的溶液Ⅲ中钾盐浓度为3mol/L、乙酸根浓度为5mol/L。 （4）、50mg/ml氨苄青霉素：取50mg氨苄青霉素，溶于1ml灭菌蒸馏水，过滤除菌。-20℃保存。 (5)、10mg/ml RNA酶(无DNA酶)：称取loomg RNA酶粉剂溶于10ml　10mmol/L　Tris·Cl(pH7.5)　15mmol/L NaCI缓冲液中水浴煮沸15分钟　缓慢冷至室温。分装-20℃贮存备用。 (6)、碱酚：纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体,使用之前必须重蒸, 除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解,重新进行蒸馏,当温度升至183℃时,开始收集在若干个棕色瓶中,纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃。使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中,加入等体积的lmol/LTris--HCl(pH8.0)缓冲液,立即加盖,激烈振荡,并加入固体Tris摇匀调pH(一般looml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6-8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中,并加一定体积0.lmol/LTris-HCl pH8.0)覆盖在酚相上,置4C冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂,能引起腐蚀性损伤,操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚,应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空气极易氧化变红,要随时加盖,也可加入抗氧化剂0.1% 8一羟基喹啉及0.2%β-巯基乙醇。 7、TE（pH 8.0） Tris-HCl 10mmol/L(pH 8.0) EDTA 1mmol/L(pH8.0) 四、仪器 低温高速冷冻离心机 控温摇床 振荡器 紫外分光光度计 五、方法 1、从LB平板上挑取单菌落接种于2ml含60μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基（加入2μl 50mg/ml的氨苄青霉素）中，37℃条件下250r/min振荡培养过夜(至对数生长后期)。 2、取1.2~1.5ml菌液移至1.5ml无菌离心管12000g离心30秒,弃去上清液,尽量去残液。 3、向离心管内加入100μl冰预冷的溶液I涡旋振荡悬浮菌体。 4、加入200μl新配制的溶液Ⅱ，迅速盖严离心管盖，快速颠倒〈千万不要振荡〉离心管5次，将离心管放置冰上。 5、中加入150μl溶液Ⅲ ，盖紧管口，颠倒离心管10次，置冰上3~5分钟。 6、4℃ 12000g离心5分钟，将上清液转入1.5ml无菌离心管。 7、加等量的酚：氯仿（1：1），振荡混匀，4℃ 12000g离心2分钟，将上清转到另一离心管中。 8、加等体积的氯仿抽提1次，4℃ 12000g离心2分钟，将上清转到另一离心管中。. 9、加入2倍体积无水乙醇，振荡混合，于室温下放置2分钟。 10、加入1ml 70%乙醇，放置2分钟后，4℃ 12000g离心2分钟，去上清。 11、重复第9步，尽量去残液，在空气中干燥DNA。 12、用50μl TE溶解质粒DNA，加入1μl 10mg/ml的无DNA酶的RNA酶，室温放置30分钟。 13、电泳检测纯度紫外吸收法测定含量。 六、说明 1、质粒DNA提取的方法很多本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法包括下述步骤：(1);(2)质粒和染色体DNA的分离;(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分;(4)除去提取过程中