植物根尖细胞的类角蛋白中间纤维.pdf

植物根尖细胞的类角蛋 白中间纤维 邢 力 黄景花 杨 澄 (北京大学生物系，北京 t0087t) 关蕾调 豌豆根尖细胞、中间纤维 角蛋白、选择性抽提、免疫印迹法 中间纤维一直被认为是广泛存在于动物细胞 中的一类细胞骨架系统，它的直径是 10nm． 那 厶／在植物细胞中是否存在 中间纤维?人们 曾从多方面做过探索 ，但至今还是一个没有解决 的问题．Dawson(1985)和 Miller(1985)用免疫化学的方法初步证明在洋葱根尖细胞和衣 藻 (Algac^如myDmDnd1)中有类似动物细胞中间纤维的抗原物质存在 “一．Powell(1982) 从悬浮培养 的胡萝 原生质体 中能观察到抗非离子去垢剂和高盐溶液 的7rim 纤维 ．Good— body(1989)虽证明中间纤维抗体可同悬浮培养的胡萝 卜原生质体发生阳性反应，但免疫金 颗粒都是结合在微管上 ． 因此以上这些工作都没有说明植物细胞 内是否存在 l0rim 中间纤 维 ，更没有说明其蛋 白质成分是什么． 苏菲、翟中和(1989、1990)用选择性抽提技术首次证明在玉米和烟草叶肉细胞中存在类似 动物细胞中间纤维的网状结构，这些纤维与动物细胞角 蛋白抗体有阳性反应 ． 为了进一 步证明植物细胞中间纤维是否确切存在，以及类角蛋 白中间纤维是否在植物各种组织的细胞 内广泛存在，我们主要选用豌豆根尖细胞作材料进行了研究，并以黄豆、蚕豆根尖细胞和 白 菜、蚕豆叶肉细胞作对比试验，不仅证明植物叶肉细胞 内含有类角蛋白纤维，而且首次证明在 植物根尖细胞 内也存在 l0rim 的纤维 ，并含有二种类角蛋 白，其分子量为 52和 64kD． 一 、 材 料 及 方 法 1．原生质体的分离 挑选豌豆种子 50粒在室温下黑暗的条件 中萌发二天后，取 狠 尖 lcra，横切成 05一1．0mm 厚的薄片 ，在台有 3％的纤维素酶 (OnozukaR-10)和 0．5％的 离析酶 (YakultR一10)的 CPW ；溶液中酶解 (cPw ，溶液：13fo(w／)甘露醇、KH：P04 27．2mg／L KNO3l01mg／L、CaCL2·2HzO l480mg／L．MgSq ·7HzO 240mg／L、K10．16 mg／L、CuSO,·5H：O 0．025mglL，pH5．6)，30℃ 条件下用摇床振荡 3—4h，胞壁被酶解后用 200目尼龙网过滤，1500rlmin离心 5rain沉淀原生质体，用 CPW ，溶液冲冼二次，此时原生 质体在光镜下呈均匀的圆球状． 取 白菜或蚕豆真叶数片 ，撕去下表皮后放人 15ml台 0．5％纤维素酶及 0．5％ 离析酶的培 养液中(台 4．55％(W／V)山梨醇、455％(W／V)甘露醇、0．5％( )CaC12·2H：O，pH6．2)， 30℃条件下酶解 3—4h．胞壁被酶解后用 200目尼龙网过滤 ，500r／min离心沉淀原生质体， 用培养液洗原生质体二次，镜检可见原生质体里球形，叶绿体均匀分布． 置细胞成分的选择性抽摄 原生质体用台 0．5弼 TritonX—l00的 CSK 溶液轻 轻 吹 奉 文 1990年 7月3t日收到。 ·国家 自然科学基金资助项目． 第 8期 辩 学 通 报 散 ，静置 3—5min(CSK液 ：l0mmol／LPIPES、300mmolIL蔗糖 、l00reotol／LKC1、3mmol／L MgC12·6H2O、1．2mmol／LPMSF，OH68)，溶去原生质体膜和大部分可溶性蛋 白质 ，1000 r／rain离心 5rain，弃去上清液 ，沉淀用 RSB—Magik溶液吹散 ，静置 5—7min (RSB—Magik溶 液：42．5reotol／LTris、85reotol／L NaC1、2．6mmol／MgCiz-6H2O、l_2mmol／L PMSF、1，矗 Tween一40，0．5％脱氧胆酸钠 ，pH8．3)，此步骤可以去掉微管、微丝和其它一些结构蛋 白质 ，此 时胞质 内主要存 留中间纤维，l000r／rain离心 5min后保留沉淀．以上操作均在 4℃ 条件 下 进行． 上述沉淀用含 DNaseI(100~glm1)的 DB溶液