323结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种即戊二醛交联.PPT

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323结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种即戊二醛交联

结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测,效果更好。 制得结合物,最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时,能维护一个低的本底,并获得测定的最佳灵敏度,达到最合适的测定条件和测定费用的节省。 3.2.4 结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质,易失活。高浓度较为稳定,冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油,加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵,AP结合物可加叠氮钠)。 3.2.5  结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上:0.1%牛血清白蛋白, 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液,使用时不需再行稀释,在4-8℃保存期可达6个月。 试剂准备 C 酶的底物 3.3  酶的底物 3.3.1  HRP的底物 OPD氧化后的产物呈橙红色,用酸终止酶反应后,在492nm处有最高吸收峰,灵敏度高,比色方便,是HRP结合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中, DH2为供氧体, H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物,经酶作用后成为有色的产物。 DH2如:邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 E TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定,可配成溶液试剂,只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后,TMB产物由蓝色呈黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感,但空白值极低,也为一些试剂盒所采用。 HRP对氢受体的专一性很高,仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。 AP的底物为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚,在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮),可用于ELISA作荧光测定,敏感度较高于用显色底物的比色法。 3.5  酶反应终止液   常用的HRP反应终止液为硫酸,其浓度按加量及比色液的最终体积而异,在板式ELISA中一般采用2mol/L。 4 对照设定 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品,同时也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致,多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称; 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较,可以估计标本物质的量。  参考标准品 定量测定(如甲胎蛋白质,癌胚抗原测定等)应含有制作标准曲线用的参考标准品,应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度,一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中. 阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是阴性。 原理 类型 试剂准备 对照 标本 结果 * ELISA 知识简介 1. ELISA的原理 2. ELISA的类型 3. 试剂准备:免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4. 对照设定 5. 标本的采取和保存 6. 结果判断 ELISA是一种免疫测定(immunoassay,IA) 。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析。 1. ELISA的原理 酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay),简称ELISA。 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 1.1 抗原抗体反应 1.1.1 可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡,其反应式为: Ag+Ab→Ag·Ab  抗体的亲和力(affinity),可以用平衡常数K表示:K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合,两者结合牢固,不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。 1.1.2 特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构

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