试验三血清醋酸纤维薄膜电泳.PPT

实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 主讲：肖贵榜 实验目的： 掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的一般原理和方法。 熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中清蛋白与球蛋白的比值。 氨基黑10B 氨基黑10B ,苯胺蓝黑，酸性黑1,萘酚蓝黑，酸性黑10B，Acid Black 1 一、电泳的原理 电泳：带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。 以蛋白质为例： 醋酸纤维素薄膜电泳 它是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120mm。 优点：强渗透性，对分子移动阻力很弱，简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰和没有吸附现象。 电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即 影响电泳速度的主要因素 1.样品本身: 分子带电量：Q越多，u越大； 分子大小:分子小，r越小，u越大； 分子形状： 形状越小，与支持物介质摩擦 越小，u越大。 球形分子 纤维状分子 2.缓冲溶液： A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大 3.电场强度(X): 实验步骤： 点样操作示意图  电泳装置 预试结果图（供参考） 实验结果： 注意事项： 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 4、点样后膜条的放置：区分电极正负极，膜条点样端接于负极且点样面向下。 5、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀。 * * 实验试剂： 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH=8.6，离子强度 0.075)：称取2.768g巴比妥和15.458g巴比妥 钠,置于大烧杯中，加蒸馏水约600ml，稍加 热溶解，冷却后用蒸馏水定溶至1000ml。置4 ℃保存，备用。 2、氨基黑10B：氨基黑10B 0.5克, 甲醇50ml,冰乙酸10ml ,蒸馏水40ml 。 3、漂洗液：取无水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏 水50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。 3、0.4N氢氧化钠：称取氢氧化钠16.0g，蒸馏水 加至1000ml 实验器材： 1. 电泳仪：为电泳提供直流电源。 2. 电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。 3. 血清加样器 ：可用盖玻片或X胶片或微量加样器。 4. 醋酸纤维素薄膜：2cm×8cm 5. 其它： 培养皿（直径9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子等。 DYY-5型稳压 稳流电泳仪 DYY-Ⅲ型 电泳槽 实验原理： pHpI pH=pI pHpI H＋ H＋ OH－ OH－ 蛋白质兼性离子 蛋白质阳离子 蛋白质阴离子 （等电点） 人血清中几种主要蛋白组分 占总蛋白的％ 分子量 等电点 血清蛋白质　　　　　　　　　　 12～20 156,000～950,000 6.85～7.3 γ－球蛋白　　 　　　 6.5～12 90,000～150,000　　 5.12 β－球蛋白　　　 　　　 4～9 300,000　 5.06 α2－球蛋白　　　　　　　　　 　　　 2～5 200,000 5.06　 α1－球蛋白　　 　　　 　　　　 57～72 69,000 4.64　 清蛋白　　　　 　　　　　　　　 缓冲液pH=8.6 pI＜pH 血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。 V—粒子运动的速度 X—电场强度 Q—粒子所带电荷 r—粒子的半径 η—介质的粘度 B.离子强度(I)： 离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动的速度越快。 选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.02～0.2之间。 电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。 X越大，u越快。支持物越短， X越大， u越快。 电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离