公禽的精子与精液.ppt

第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （一）禽类的体外受精和胚胎移植 1、体外受精 ①母鸡在产蛋后15分钟或20分钟回收排出的卵子，收集的卵子放在含有60～70ml改良的Ringer’s液中，取0.2～0.5ml稀释的精液，放在胚珠上，并在410C的条件下培养15分钟，使其体外受精，之后，在Ringer’s溶液中漂洗以除去精子。 ②将母鸡输卵管喇叭口拉出，撑开，体外受精的卵从烧杯灌入张开的喇叭口，使卵移向输卵管膨大部前部，放回卵巢囊中，缝合切口。 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （一）禽类的体外受精和胚胎移植 2、胚胎移植 Tanaka(1994)移植了76个体外受精获得的受精卵产出53个正常蛋，31枚受精，孵出6只雏鸡。 （二）禽类早期胚胎体外培养 1、人造材料蛋壳培养体系 人造材料蛋壳培养是一种完全脱离天然蛋壳，采用人造材料容器等进行的鸡或鹌鹑胚胎体外培养方法。 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （二）禽类早期胚胎体外培养 2、代用蛋壳体系 我国禽类胚胎体外培养技术: ①胚胎发生阶段的鸡胚：从囊胚到孵化72小时（鸡）或到60小时（鹌鹑），直接把新生鸡胚在常规下孵化72小时，或以切去锐端的普通蛋壳作为代用壳,整个卵黄移入其中,注满培养液,无毒薄膜密封,纵轴水平方向固定,继续孵化。 ②72小时到出雏：取切去钝端的双黄蛋壳作为代用壳,胚胎移入后注入单纯稀蛋白至蛋壳切口下一定位置,无毒薄膜封口,继续孵化。 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （二）禽类早期胚胎体外培养 3、三期培养体系 ① Ferry（1988）首先建立了受精卵－囊胚的体外培养方法：将卵裂前受精卵（连带卵黄和部分浓蛋白）胚盘向上置于60ml的玻璃杯中，注入培养液至胚盘水平位置，无毒薄膜密封杯口，41～42℃培养24h。 ② Ono（1994）改用20ml塑料杯，以单纯稀蛋白为培养液，41.5 ℃培养24h。 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （三） 禽类嵌合体技术 1、禽类嵌合体制作方法 ①囊胚细胞分离； ②注射卵进行孵化； ③蛋的内容物转移入大一点的蛋壳中，重新封口。 2、禽类嵌合体制作分类 （1）胚盘细胞嵌合体：1970年，Marzullo 将白莱航鸡的胚盘细胞注入到横斑洛克鸡的胚盘内，从孵化后期死亡的雏鸡羽色来看，得到了嵌合胚胎。 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （三） 禽类嵌合体技术 2、禽类嵌合体制作分类 （2）原始生殖细胞(PGCs)嵌合体： 1976年，Reynaud切下公鸡生殖嵴部位制成细胞悬浮液，注射到紫外线照射过的鸡胚血管里，发现公鸡PGSS随血流移动到鸡生殖腺中生存， Tajima通过移植从鸡胚血液中分离纯化的PGCs成功获得了白莱航鸡和洛岛红鸡的性系嵌合体。 （3）种间嵌合体：Hajji等将鹌鹑生殖嵴部位的PGCs，注射到鸡胚血管里，性分化后在鸡的生殖腺中发现了鹌鹑的PGCs，并获得了供体后代。 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （三） 禽类嵌合体技术 3、禽类嵌合体鉴定 注射鹌鹑囊胚细胞的鸡胚组织在孵化12小时后进行观察。组织固定在Zenker’s液中，切片厚度为6μm，Feulgen-Rossenbecks染色，按照Le Douarin的方法辨别鹌鹑囊胚细胞和鸡囊胚细胞。 第三节 禽类繁殖生物技术 三、家禽的转基因技术 （一） 转基因技术 1、成熟卵泡微注射法 即向母鸡排卵前成熟卵泡中注射外源基因。Shuman（1986）注射反转录病毒，Kopchich注射牛GH基因。 2、受精卵原核微注射法 注射部位是受精卵胚盘质膜下方20um处的细胞质。 3、单细胞受精卵微注射法 Sang等和Perry等用微注射法将CMVIElacZ环形质粒注入受精卵中央，之后进行体外培养,在胚胎原肠胚期，表达β-gal酶活性。外源基因散在细胞质中, 并没有整合到染色体中。 第三节 禽类繁殖生物技术 三、家禽的转基因技术 （一） 转基因技术 4、转染1日龄胚盘法 鸡产蛋后立即收蛋并储存在15℃。在不损伤壳膜的情况下，去除部分蛋壳，定位胚盘，用玻璃毛细管向胚盘注射1-100μg的pBGH-4DNA，正常孵化。 5、反转录病毒