AYL-S7-301APINH奈瑟氏球菌和嗜血菌鉴定30.doc

编写者：沈继录 审核者： 批准人： 生效日期：2012.1.1 文件发放范围：微生物组 文件年度审核 审核者： 审核者： 审核者： 审核者： 日期： 日期： 日期： 日期： API NH奈瑟氏球菌和嗜血菌鉴定 1．原理与目的 　　API NH试验条是由10个含干燥底物的小管所组成，这些底物可进行12个鉴定试验（酶反应和糖发酵）和检测青霉素酶。培养后的反应结果可从自然变色或加入试剂后呈现而得。是奈瑟氏球菌属、嗜血菌属和卡他布兰汉氏菌的鉴定系统，也能鉴定流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）和副流感嗜血菌（Haemophilus parainfluenzae）的生物型和青霉素酶的检测，协助临床诊断。 2．试剂 一套包括（10次）测定： 10个API NH试验条 10个安瓿0.85%NaCl培养基（3ml） 1个安瓿JAMES试剂 1个安瓿ZYM B试剂 10支棉签 10个培养盒 10份报告单 1份说明书 3． 验条和附加试剂的贮存 3.1 所有试验条需储藏于2-8℃直至有效期。 3.2 附加试剂在有效期内应贮于黑暗的2-8℃中 3.3 试剂在安瓿瓶打开后，或将试剂转到滴瓶中（打开日期必需标在瓶上），只有一个月的有效期。 3.4 ZYM B和JAMES试剂对光敏感：瓶应包在铝箔中，只有用时才从冰箱中取出，同时应避免长时间放在室温中。ZYM B试剂在有效期内应为黄色，当试剂转为暗粉红色，请丢弃。 4．使用培养基 　　加有Poly Vite X的巧克力琼脂或类似琼脂（T-M琼脂），加或不加抗生素。 5．具体操作方法 5.1 选取菌落 　　所选菌株必须属于以下菌属：　 奈瑟氏菌属（革兰氏阴性球菌通常邻近成对排列）； 卡他布兰汉氏菌亦呈相同的形态及生理特征； 嗜血菌属（革兰氏阴性多形态，有营养要求的小菌落）。这些细菌营养要求高，常需培养在加有Poly Vite X的巧克力琼脂上，富CO2大气环境。 5.2 试验条的准备 准备培养基（盘和盖）； 在盘的沿边写上菌株号； 从包装中取出试验条置放盘中。 5.3 接种物的准备 开启0.85%的NaCl培养基（2ml）； 用一无菌棉签，挑取少许单个菌落，制成相当于4个麦氏单位浊度的菌悬液，充分混匀。 5.4 试验条的接种 将菌液加于各杯内，避免产生气泡。 前7孔（PEN到URE）：只加满管的部分（50ul）。 后3孔（LIP/ProA、PAL/GGT、βGAL/IND）则完全充满：约150ul，但不要加成凸液面。 前7孔（PEN到URE）覆盖石腊油（只覆盖划底线＿的试验）。 注意：加液程度很重要，管部分加液量过多或过少会导致假阳性或假阴性结果。 盖上培养盒。 放35-37℃，有氧环境下培养2小时。 5.5 判读试验条 经过2小时的培养后，根据使用手册中的读数表判读各反应结果： 记录自然发生的反应：在结果单上记下“+”或“-”。 不需加附加试剂的反应孔，先记录下结果。 于管8和9(LIP/ProT和APAL/GGT)中各加ZYM B一滴。 于管10 βGAL/IND中加一滴JAMES试剂 3分钟后读取结果，参考使用说明书的读表，并记录于结果单上。 如果LIP反应阳性（兰色），则ProA反应判为阴性，决定加或不加ZYM B试剂。如果在经过2小时后，有几项反应（发酵、青霉素）可疑，则可将试条再培养2小时，再读一次结果（酶反应不能重读）。 5.6 鉴定 所得的反应结果编为数字图谱：在报告单上，以3个测定为一组，数字以1、2、和4标明。在每组中，每个相应的阳性反应数字相加，得出一个4位数图谱。 注意：不要将第一个反应（青霉素酶）编码，第一组试验为GLU-FRV-MAL。 结果可以从使用手册的读数表中寻找该数码。如果在几个种之间的鉴定概率不高的话，可根据列出的补充试验（表1和表2）将其区分。这些试验的结果则是取自文献。 流感嗜血菌和副流感的生物分型是根据表1作出的。 青霉素试验： 　　阳性反应（黄、黄绿、黄兰色）则表示有青霉素酶。该酶的存在，禁止青霉素类（青霉素G、　　氨基-、羧基及脲基青霉素）的使用。测定对其它β-内酰胺药物的敏感性。阴性反应（兰色）则表示无青霉素酶。 6．质量控制 　　培养基、试验条和试剂在生产的不同阶段生产厂商（梅里埃公司）都已进行严格的系统质量控制。我室依据生产厂商系统质量控制结果使用该产品 7．使用限制 　　API NH系统只能用于鉴定奈瑟氏菌属（Neisseria）、嗜血菌属（Haemophilus）和布兰汉氏菌属（Branhamella）中的细菌。不能用于鉴定范围之外的菌。 8．读表 测定 反应 底物 结果 阴性 阳性 PEN 青霉素酶 青霉素G 兰（无青 霉素酶） 黄/黄绿/黄兰 （有青霉素酶） GLU 葡萄糖（产酸） 葡萄糖 红色/红