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人锰超氧化物歧化酶hsod2-q46k突变体的表达与 - 暨南大学学报
第38卷 第3期 暨南大学学报(自然科学与医学版) Vol.38 No.3
2017年6月 JournalofJinanUniversity(NaturalScience&MedicineEdition) Jun. 2017
人锰超氧化物歧化酶hSOD2Q46K突变体的
表达与功能分析
1 1,2 1 1 1
谢 臖 , 牛得伟 , 李艳冰 , 高 可 , 高 辉 ,
1,2 1,2 1,2
李帅广 , 沈良华 , 王 峰
(暨南大学 1.药学院基因组药物研究所;
2.中药药效物质基础及创新药物研究 广东省高校重点实验室,广东 广州510632)
[摘 要] 目的:构建人锰超氧化物歧化酶(hSOD2)Q46K突变体,简化获得hSOD2突变体的步骤,探讨hSOD2
结构与功能的关系.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)体外定点突变技术将hSOD2的46位Q氨基酸突变为K氨
基酸,经测序鉴定正确后将pET15bhSOD2Q46K突变体重组质粒转化 Rosettagami大肠杆菌,通过异丙基D硫
β
代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达.利用SWISSMODELWorkspace对hSOD2Q46K突变体进行同源建模,利用
SwissPdbViewer软件对建模结果进行分析.利用NiNTA亲和层析纯化目的蛋白后用超氧化物歧化酶(SOD)检测
试剂盒检测目的蛋白的SOD活力.利用浓度为01mmol/L百草枯(PQ)压力下生长情况测定表达hSOD2Q46K和
hSOD2蛋白的Rosettagami大肠杆菌的抗氧化能力.结果:测序结果表明46位密码子已由CAG突变为AAG.经过
IPTG诱导后野生型和突变体均能表达出大小约为25kDa的蛋白.SOD活性检测表明hSOD2Q46K突变体的活力
为899U/mg,比野生型蛋白活性下降了65.4%.三维结构分析显示,突变点周围氨基酸间氢键被部分打破.结论:
成功构建hSOD2Q46K突变体并成功得到了纯化的突变体蛋白,hSOD2Q46K的 SOD活力比野生型降低了
654%,且百草枯压力下表达 hSOD2Q46K蛋白的大肠杆菌A 达到084,而野生型蛋白的大肠杆菌A 达到
600 600
114.这可能是因为突变点与周围氨基酸间氢键打破,突变点周围失去了原来的稳定结构,底物通道入口处氨基酸
排列疏散,影响电子在氨基酸间的传递,影响静电导向机制,从而阻碍氧自由基在底物通道的通行,使hSOD2的催
化活力下降.
[关键词] 锰超氧化物歧化酶; 表达; 超氧化物歧化酶活性; 突变体
[中图分类号] Q78 [文献标志码] A [文章编号] 1000-9965(2017)03-0205-09
doi:10.11778/j.jdxb.2017.03.004
Expressionandfunctionanalysisofhumanmanganesesuperoxide
dismutase(hSOD2)Q46Kmutant
1 1,2 1
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