第八章 现代实验动物学技术.ppt

现代实验动物学技术 一、转基因动物 转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果。 近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。 Gordon等人首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序TGM。 1982年Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。 到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。 从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。 （二）转基因动物的制作方法 1、受精卵雄原核显微注射法 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 3、逆转录病毒感染法 4、体细胞核移植法 5、精子载体法 6、YAC法 1、雄原核显微注射法 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。 这一方法的实验程序如下： （1）准备假孕母鼠（养母） （2）受精卵的准备 （3）基因导入 （4）胚胎移植 （5）对幼鼠的鉴定 Timing of Pre-Implantation events Expression of Exogenous Genes Screening Strategies Southerns, Induction/Loss of Restriction sites, PCR RT-PCR 测定表达产物活性：ELISA，RIA 其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时间。 基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中。外源基因的插入会引起宿主基因的DNA序列重排，缺失，重复或易位。 外源基因也可不插入呈游离状态，以质粒形式存在表达功能并传给子代，其详细机理现在也不是很清楚。 优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观； 整合率高 缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求　 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。 将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。 它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。 在ES细胞上的基因操作： 可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。 因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。 Generating ES Cells Screening ES Cell Clones Retrieval of Blastocysts Injection of ES cells into blastocysts 优点： 外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。 （三）转基因动物的特性 整合拷贝数1-100左右，多拷贝常以首尾相连接的形式存在。 整合是随机的。 整合是稳定的，可以传给子代。 外源基因可以在一种组织或多种组织中表达。 少数外源基因两侧序列有重排现象。 基因表达强弱与拷贝数无关，与“位置效应”有关。 （四）转基因动物的意义 转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发展起来的。而许多基因的表达是无法通过转染的方法来研究： 基因表达有时空与组织的特异性； 外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；因此，只有通过转基因的动物才有可能研究基因的表达、调控及基因之间的相互作用。 进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体水平的表现调控规律。 转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究。 也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要。 还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。 二、免疫缺陷动物 （Immunodeficient animal） （一）定义： 是指由于先天性遗传突变或用人工方法。造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。 （二）分类： 1、