壳青霉内切纤维素酶结合位点的研究.PDF

壳青霉内切纤维素酶结合位点的研究 熊炜 （武汉轻工大学，生物与制药工程学院） 摘要:本实验将壳青霉内切纤维素酶催化结构域和结合结构域的疑似结合位点突变成甘氨酸 通过测滤纸酶活的方法和对CD 蛋白质三级结构的预测，发现底部154Tyr、156Phe 参与纤维 素酶分子与底部纤维质的固定，活性中心的166Trp、168Trp 辅助活性位点水解游离纤维素。 通过绑定实验和等温滴定微量量热仪检测吸附曲线吸参数以及对 CBD 蛋白质三级结构的预 测，发现结合结构域的前端芳香族富足区氨基酸2His、3 Tyr 、4Tyr 形成的卡扣结构对CBD 的结合功能有巨大贡献。 关键词: 壳青霉 催化结构域 结合结构域 等温滴定微量量热仪 蛋白结构 项目来源：武汉轻工大学2014 年研究生创新基金 “壳青霉纤维素酶结合域结构域功能的研究”2014cx002 作者简介：熊炜（1991.07- ）；性别，女；硕士研究生在读；研究方向，工业酶与酶工程 Abstract: In this experiment, suspected binding sites in both catalytic domain and binding domain of endo cellulase were mutated into glycine. By the method of measurement of filter paper enzyme activity and the CD protein tertiary structure prediction, the bottom of the 154 Tyr and 156 Phe were found to involved in immobilization of cellulase and the bottom cellulase，while 166 Trp and 168 Trp in active site were involved in assisting active site to hydrolyz free cellulose.By the method of binding experiments and the ITC test adsorption curve parameters as well as to the CBD protein tertiary structure prediction, the groove, formed by 2 His, 3 Tyr and 4 Tyr of the aromatic rich area in the front of binding domain, make a huge contribution to binding function of CBD. Key words: Penicillum crustosm catalytic domain cellulose binding domain isothermal titration calorimetry protein structure 纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素 酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分解纤维素产生 [1,2,3] 寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖 。 为了实现完全水解纤维素，需要三类纤维素酶协同作用。首先，内切葡聚糖酶(EG)作用 于无定形区并随机切开内部糖链，产生纤维二糖水解酶(CBH 或外切葡聚糖酶) 的还原性或非 还原性纤维寡糖的末端。CBH 以续进性的方式水解这些链的末端，形成主要产物纤维二塘。 最后，β-葡萄糖苷酶（BG ）进一步水解纤维二糖为葡萄糖以及从可溶性纤维寡糖的非还原 [4] 性末端释放葡萄糖 。 1986 年Tilbeurgh 用木瓜蛋白酶对T. reesei 的CBH 进行了酶切，得到了两个结构域：分 别为催化结构域(catalytic domain, CD)和纤维素结合结构域 (cellulose binding domain, CBD)， [5] 它们都具有独