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彗星法DNA损伤检测试剂盒说明书
南京建成生物工程研究所 仅用于科研、实验室
彗星法 DNA 损伤检测试剂盒说明书
一、试剂盒说明
DNA 在自由基(如·OH )的攻击下容易发生损伤,即脱氧戊糖遭到破环,磷酸二脂键的
断裂,碱基的破环或脱落,便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖
中,取少量细胞涂在载玻片上,用碱高盐溶液破坏细胞膜,再用碱溶液使 DNA 分子解旋。将
载玻片置于电泳液中,在电场的作用下,DNA 分子向阳极移动。如果 DNA 损伤严重,碎片多,
则电泳速度快。未受损伤的 DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔,滞留在原处。用 PI 染色或银染,
可观察到 DNA 受损的细胞形同彗星现象,作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。
二、试剂盒组份
组份 规格:20 assays 储存条件
Lysis Bufffer 100ml 4 ℃
DMSO 8ml 4 ℃
正常熔点琼脂糖 NMA 30mg 4 ℃
低熔点琼脂糖 LMA 30mg 4 ℃
Propidium Iodide (PL ) 400 μl 4 ℃避光
三、所需仪器及自备试剂
低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和45 ℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、
微量移液器、1.5ml Microube、0.4mmol/LTris-HCl (pH7.5 )缓冲液、PBS
四、注意事项
Propidium Iodide (PI )和EB 有毒,操作时要戴手套。
五、操作步骤
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1 、细胞用冰冷的PBS洗一次,离心收集,用PBS重悬使其密度为 1x10 个/mL ;
2 、铺胶:下述各浓度琼脂糖凝胶均用 PBS 配制,
第 1 层凝胶的制备:将载玻片的磨砂面向上,45 ℃预热,将预热 45 ℃的 100 μL 的 0.5%
正常熔点琼脂糖(NMA )铺于载玻片上,盖上干净的盖玻片,再置4 ℃下 10min使NMA
凝固。
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第 2 层凝胶的制备:将 10 μL细胞(约 10 个)和 75 μL 的0.7%低溶点琼脂糖LMA
(在37℃下水浴加热至少20min 使之完全溶化)混合均匀。然后,轻轻揭去盖玻片,迅
速将含细胞的 LMA 滴到第 1 层琼脂糖上,立即盖上另一干净盖玻片,置 4 ℃10min 使第
2 层 LMA 凝固。
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南京建成生物工程研究所 仅用于科研、实验室
第 3 层凝胶的制备:第 2 层LMA凝固后,在室温下小心移去盖玻片,滴加预热 37℃的
75 μL 的 0.7%低溶点琼脂糖LMA ,如上盖上盖玻片 4 ℃下凝固(第三层覆盖第二层周围
0.5mm,增加凝胶化作用时间至 30min,高湿度环境)。
3 、细胞裂解 移去盖玻片,将玻片置于平皿中,倒入预冷的 Lysis Bufffer (使用前每9mL
加入 1mL 的DMSO ),4 ℃裂解 1~2h,取出载玻片用PBS 漂洗。
4 、DNA 碱解旋 将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液(用户自备
1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH ),约覆过载玻片胶面0.25cm 左右,室温放置 20~60min,
以便使DNA 在碱性条件下解螺旋和产生碱易
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