整合缺陷型重组慢病毒载体构建及HCV重组.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（６）：６２６７ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 技术与方法 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 整合缺陷型重组慢病毒载体构建及ＨＣＶ重组 假型慢病毒颗粒的制备与性状分析 １，２ １ １ １ １ １ 管　洁 　邓　瑶 　文　波 　陈　红 　王　文 　谭文杰 （１卫生部医学病毒与病毒病重点实验室　中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所　北京　１０２２０６） （２煤炭总医院中心实验室　北京　１０００２８） 摘要　为提高慢病毒载体应用的安全性及改进ＨＣＶ新型颗粒疫苗的制备，首先对传统的慢病毒 三质粒系统进行改造：将包装质粒 ｐＨＲ’ＣＭＶ Ｒ８．２改造成整合缺陷型的包装质粒 ｐＨＲ’ Δ ＣＭＶ Ｒ８．２Ｄ６４Ｅ，并在体外感染实验验证其整合缺陷性；将转移质粒中的报告基因ＧＦＰ替换成 Δ ＨＣＶ的ＮＳ３基因，选用表达３种亚型（１ａ、１ｂ、２ａ）ＨＣＶ包膜Ｅ１Ｅ２的包膜质粒，用改造后的三质粒 系统制备了３种亚型（１ａ，１ｂ，２ａ）的假型丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）整合缺陷型慢病毒颗粒，并用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法确定了颗粒上包膜蛋白的表达，通过电镜可观察到浓缩后的ＨＣＶ慢病毒颗粒结 构，ＨＣＶ慢病毒颗粒感染Ｈｕｈ７细胞后可观察到转基因ＮＳ３的表达。为安全高效的慢病毒载体 的应用及ＨＣＶ假型颗粒疫苗研发提供了新的技术路线。 关键词　整合缺陷　慢病毒载体　丙型肝炎病毒　假型颗粒 中图分类号　Ｒ３７５．１ ［１］ 　　慢病毒载体能够容纳多达８ｋｂ的外源基因 ，在 种型别（１ａ、１ｂ、２ａ）的ＨＣＶ整合缺陷型的慢病毒颗粒， 体内体外均能高效转导包括 ＤＣ细胞在内广泛的细胞 对该疫苗中靶抗原的表达及颗粒形态进行了分析鉴 ［２］ 定，设计了一种新型的以慢病毒载体为基础的ＨＣＶ慢 类型 ，能够整合外源基因到宿主基因组中引起持续 ［３］ 病毒颗粒疫苗。 的基因表达，且没有预存免疫 ，载体骨架的免疫原性 弱［４５］。由于这些独特的特征，慢病毒载体作为一种有 １　材料与方法 效的基因转移工具，逐渐应用于基础生物学、基因治 疗、干细胞研究等多个领域，也用于传染性疾病或肿瘤 １．１　质粒、细胞和抗体 ［６］ 　　丙型肝炎病毒包膜质粒ｐＶＲＣＪＦＨ１Ｅ１Ｅ２、ｐＶＲＣ 疫苗的研究中 。但慢病毒的整合特性是慢病毒载体 广泛应用的主要安全隐患［１，３，６］。因此本研究首先对传 ＨｅｂｅｉＥ１Ｅ２、ｐＶＲＣＨ７７Ｅ１Ｅ２为本科室前期构建及保 ［７］ 统的慢病毒载体进行改造（去除慢病毒载体的整合特 存 。慢病毒包装 系统 ｐＶＳＶＧ、ｐＣＳＣＧ、ｐＨＲ’ ＣＭＶ Ｒ８．２以及 ｐＮＬＩＮＤ６４Ｅ均来源于 Ｄｒ．ＣｈｏｗＳＡ 性），构建了整合缺陷型重组慢病毒载体，体外验证了 Δ 其整合缺陷特性；在整合缺陷型重组慢病毒载体基础 （ＵＣＬＡ），由本室保存。ｐＮＬＩＮＤ６４Ｅ是表达整合酶突 上，我们进一步将报告基因替换为疫苗靶抗原 ＨＣＶ 变的全长 ＨＩＶ１的质粒。ｐＵＣＨ１５５为本科室前期合 ＮＳ３，用 ＨＣＶ包膜蛋白Ｅ１Ｅ２替换 ＶＳＶ包膜，制备了３ 成构建的表达ＨＣＶＣＥ１Ｅ２