转基因鉴定与安全性评估.ppt

三、转基因的检测 （一）遗传标记法 在表达载体中安装选择性基因 如对某种抗生素的抗性基因，对某种除草剂的抗性基因等 在表达载体中安装报告基因 转化处理过的受体在相同条件下都能生长，但转化体具有非转化体所不具有的某种特殊表现（称为显性的报告基因），或者转化体不具有非转化体的表现（称为隐性的报告基因）。 1. 利用选择性基因 （二）分子生物学方法检测 1、 DNA水平 模板 template 引物 primer dNTP Taq 反应缓冲液：离子Mg2+等 （1）取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中； （2）加入800 μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次，20min后12000 r/min，离心15 min； （3）小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min； （4）小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。 （5）重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止； （6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000 r/min，离心10 min； （7）弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次； （8）室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。 SDS方法提取gDNA （2）核酸分子杂交法  核酸杂交 一、提取基因组总DNA 二、基因组DNA的限制酶切　　根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。1. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。2. 电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。 四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物（一）试剂准备１．变性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl。２．中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl; ３．转移液（20×SSC）： NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠82.2g，NaOH 调pH 至7.0，加ddH2O至1000ml。（二）操作步骤1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。2.中和:将凝胶转移到中和液15min。3．转移 ：转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。）4. 转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80°C烘2hr，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。 五、探针标记进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：1．取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。2．在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5×buffer 10μl（含有随机引物）dNTPmix 2μl(含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)BSA（小牛血清白蛋白） 2μl [a-32P]dATP 3μlKlenow酶 5U3．将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混匀。室温或37℃ 1hr。4．加50μl 终止缓冲液终止反应。 六、Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。 1．预杂交NC膜浸入2×SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到65℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hr。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。2．杂交倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。 七、洗膜与检测SSC和SDS Western Blot详细过程