淋巴细胞分离实验.ppt

免疫学实验一 外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞的分离 原理 试剂和仪器 实验步骤 注意事项 原 理 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 原 理 实验步骤 1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2） 实验步骤 3.20℃，1500r/min，离心30min 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中 实验步骤 5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清 7.适量的培养基重悬细胞 ，计数 试剂和仪器 淋巴细胞分层液（Ficoll，低温避光保存），Hanks液，RPMI1640，PBS，小牛血清，华氏管，50ml离心管，2ml（5ml）吸管，水平离心机 注意事项 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释 2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 细胞计数 试剂和仪器 实验步骤 注意事项 试剂和仪器 血球计数板，盖玻片，Hanks液，RPMI1640，2ml（5ml）吸管，华氏管，移液尖，微量移液器，显微镜 实验步骤 1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数 实验步骤 5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104 注意事项 1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数 实验要求 华氏管中加入血样后，用记号笔作好标记 实验完毕后，请清洗试管、吸管和计数板 试验报告要求 试验内容 (原理、步骤), 结果 试验注意事项 * * 外周血 红细胞 粒细胞 单个核细胞 血小板 淋巴细胞 单核细胞 1.093 1.030~1.035 1.075~1.090 Ficoll：1.077±0.001 (PBMC) 1.092 1500rpm, 20℃ , 30min PBMC 红细胞粒细胞 Ficoll 稀释外周血 Ficoll 稀释的血浆、血小板 *