第04章 吸附层析.pptx

第二部分 分离技术;第4章 吸附层析Adsorption Chromatography;4.1、层析法概述; 1901年，俄国植物学家茨维特将植物色素提取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在在柱中得到分离而形成不同颜色的谱带。混合色素通过碳酸钙微粒被分离成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分离成不同色带的光谱现象一样。 1906年在一篇论文中将这种方法正式命名为色谱法，色谱法由此得名。;;1931年， R.Kuhn采用同样的方法从蛋黄中分离出黄体素、从玉米中分离出玉米黄色素。色谱法此时才开始为人们所重视。 1941年，Martin成功地用具有亲水能力的硅胶介质填充的层析柱分离氨基酸。提出液一液分配层析最初的塔板论。 20世纪50年代，Cermerr等发明了气相层析技术。 20世纪60年代后，高效液相层析技术得到发展。 ; 利用混合物中各组分的理化性质（如溶解度、吸附能力、电荷、分子量、分子极性、亲和力等）各不相同，使各组分在支持物上移动速度不同而集中分布在不同的区域，借此将各组分分离。 层析不只是分离技术，也是一种分析方法。;①所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶剂。 ②层析过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。 ③被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。 ;组分A 组分B;（一）依操作形式分 分为柱层析、薄层层析和纸层析。;（二）依流动相分 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。 ;（三）依分离机理分 1.吸附层析 2.分配层析 3.凝胶过滤 4.离子交换层析 5.亲和层析 6.疏水层析;七、层析技术的应用范围;4.2、吸附层析（adsorption chromatography）;在吸附柱层析中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂物质。 在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点，这些位点通过范德华力、氢键或静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合，其结合力的大小与各种生物大分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。 混合物在层析柱中的分离过程，实质上是吸附、解吸附、再吸附的连续过程。 ;二、吸附层析介质;羟基磷灰石;分离机理;硅胶;硅醇基能够通过氢键的形成吸附水分，硅胶的吸附力随着吸水量增加而降低。 若吸水量超过17%，吸附力极弱不能用作吸附剂。 硅胶的活化：当硅胶加热到100-110 ℃时，硅胶表面因氢键所吸附的水分被除去。 当温度升高至500 ℃时，硅胶表面的硅醇基也能脱水缩合转变为硅氧烷键，从而丧失囚氢键吸水的活性，因此硅胶的活化不宜在较高温度进行。 ;硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的分离。 同时硅胶是一种弱酸性的阳离子交换剂，硅醇基可以释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物可因离子交换而被吸附。 ;碱性氧化铝：直接用氢氧化铝高温脱水而得。主要用于分离碳氢化合物及某终中性或碱性化合物。 中性氧化铝：碱性氧化铝煮沸后水洗至中性，晾干后高温活化。主要用于分离醛、酮、醌类及核苷类化合物等。 酸性氧化铝：氧化铝盐酸酸化。主要分离酸性色素及醛酸类化合物。 ;活性炭;三、实验技术;2、溶剂和洗脱剂的选择 一般所选择的溶剂要求纯度合格，与样品和吸附剂不起化学反应，对样品组分的溶解度大，粘度小，易流动，容易与被洗脱组分分开。 ;在选择溶剂和洗脱剂时，要根据样品组分的溶解度、吸附剂的性质、溶剂极性等方面综合考虑。 为了增强吸附效果，可选用极性小的作溶剂； 为了增强洗脱效果，可选用极性大的作洗脱剂。 若样品是酸性组分时，可以选择含有一定盐离子浓度的碱性缓冲液进行洗脱； 若样品时碱性组分时，可选择含有一定盐离子浓度的酸性缓冲液进行洗脱。 ;3、层析柱的制备与层析操作 ;;1）．层析柱 绝多数层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。 柱的直径与长度之比，一般为1：10～1：40。 采用极细颗粒吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。 反之，则宜用比例小的层析柱。 这样有利于节省时间和提高分辨率。; 2）．吸附剂的用量 根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。 当操作容量高时，吸附剂用量少。 一般吸附剂的用量为被分离样品的30--50倍。 若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于100倍。; 3）．装柱 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。 装柱后，层析柱中基质应符合如下标准