一株产香真菌的筛选鉴定及脂肪酶基因序列克隆分析.docVIP

　　一株产香真菌的筛选鉴定及脂肪酶基因序列克隆分析 孙 媛１ａ，余玉莎１ａ，李梦娇１ａ，周 斌２，张芬芬１ｂ，李 玲１ａ，王继英１ａ，赵明富１ａ，文国松１ｂ （云南农业大学，ａ．农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室；ｂ．农学与生物技术学院，昆明 ６５０２０１； ２．云南大学微生物研究所，昆明 ６５００９１） 摘要：从香料植物天竺葵上分离筛选到一株产香真菌，对该菌株进行鉴定，确定其分类地位，并克隆其产脂肪酶基因进行序列分析。结果表明，分离筛选得到的菌株ＴＺＫ－１形态为菌落圆形，质地疏松，菌丝由白色变为灰褐色，菌丝无隔膜，有假根，孢囊梗基部膨大形成球形孢子囊，孢囊孢子椭圆形；该菌株１８Ｓ ｒＤＮＡ序列与米根霉Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＫＦ７１７３７０）相应片段的核苷酸序列同源性为９９．６％。利用ＰＣＲ扩增得到脂肪酶基因，该基因编码区全长为１ １０８ ｂｐ，编码３６９个氨基酸，脂肪酶核苷酸序列与推导的氨基酸序列与Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＡＦ２２９４３５）和Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＪＮ６８９９８８）聚为一支，支持强度分别达到９２％和９５％。结合形态学初步确定，产生浓郁甜酒香味的菌株为米根霉，能产生脂肪酶，克隆其脂肪酶基因全长。 .. 关键词：真菌；筛选；脂肪酶；ＰＣＲ扩增 中图分类号：Ｓ１８８文献标识码：A：0439－８114（２０15）05－1227-05 ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．0５．０5０ 收稿日期：２０１４－０８－０８ 基金项目：云南省烟草公司项目“微生物菌剂在烟草病害防治中的应用研究”（２０１１ＹＮ５８） 简介：孙 媛（１９８８－），女，云南曲靖人，在读硕士研究生，研究方向为植物病理，（）１３５７７１４２０５３（电子信箱）１８３６５８７９４＠ｑｑ．ｃｏｍ； 通信，赵明富，副教授，主要从事植物病理和微生物研究，（电子信箱）ｚｈａｏｍｉｎｇｆｕ＠１６３．ｃｏｍ；文国松，副研究员，主要从事中药材研究， （电子信箱）ｗｅｎｇｓ＠１６３．ｃｏｍ。 脂肪酶（Ｌｉｐａｓｅ，Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）是一类特殊的酯酶，可以在油水界面上催化长链甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油，在非水相系统中，可以催化转酯和酯合成等多种反应［１］。通过改变反应体系的水含量便可以控制脂肪酶催化的反应方向，可以进行水解、酯合成、酯交换、转酯化等一系列反应。脂肪酶在常温常压下反应具有反应条件温和、转化率高和特异性强，不易产生副产物等特点，从而能避免化学催化带来的有害物质。因此，脂肪酶越来越多地运用于光学活性化合物和天然产物的合成，如在食品、饲料、洗涤、纺织、能源等加工业中应用广泛［２，３］，成为重要的工业酶制剂之一。脂肪酶广泛存在于植物、动物和微生物中，其中微生物脂肪酶具有种类多、底物专一性类型多、独立的脂肪酶基因易获得等优点［４］，因而微生物是脂肪酶的一个重要，其中根霉属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）是脂肪酶的重要生产菌［５］。根霉属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）是一类分布较为广泛的真菌，属于接合纲毛霉目毛霉科，分布于酒曲、植物残体、腐败有机物、动物粪便和土壤中，在传统和现代发酵工业中有着重要作用。其中与生物技术相关的根霉有匍枝根霉（Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）、华根霉（Ｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）［６］、德氏根霉（Ｒ． ｄｅｌｅｍａｒ）［７］和米根霉（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）［８－１１］。目前已从根霉属中分离到超过３０种脂肪酶，如米根霉脂肪酶、雪白根霉脂肪酶、德氏根霉脂肪酶等，这些酶已经商品化，如根霉脂肪酶用于芳香酯［6］、生物柴油［12］、手性化合物［１3］等有机化学物的制备，因此根霉脂肪酶具有一定的研究价值。 目前，已经从不同种属的微生物中分离得到产脂肪酶菌株，并对其进行了深入研究。随着分子生物学［１4］的发展，国内外报道了不同微生物脂肪酶基因已被成功克隆［１5］，通过数据库比对分析脂肪酶序列，可以发现在相同或者相近的种属内脂肪酶的同源性相对较高，从而找到相对保守的结构域。本研究从石林香料植物天竺葵叶表面分离到一株产脂肪酶菌株，通过提取基因组ＤＮＡ以真菌通用引物（ＩＴＳ１／ＩＴＳ４）进行ＰＣＲ扩增，并结合形态学对该菌株进行鉴定，然后设计引物利用ＰＣＲ扩增米根霉脂肪酶全基因序列，并对分离菌株进行发酵代谢成分分析，为米根霉的运用提供了异源表达和分子育种材料，为其代谢产物的研究和开发奠定基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 菌株 由石林香料天竺葵样品中自行分离、纯化并保存的菌株。 １．１．２ 主要试剂和仪器 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、乙酸乙酯、无水硫酸钠等均为国产分析纯；２×Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ试剂盒、ＢＭ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋ购