第一部分 蛋白质化学.ppt

蛋白质的分离、纯化与鉴定 （二）蛋白质混合物的分离方法（蛋白质纯化方法）  （2）凯氏定氮法的优缺点 优点：适用于一切形态的样品，无论是固体还是液体都可以获得精确的分析结果。尤其是当样品溶液浑浊时，用其他方法不能进行蛋白质含量分析。而采用凯氏定氮法仍能可以获得可靠的结果。 缺点：样品中存在非蛋白氮对测定值有直接影响，测定前需除去；在构成蛋白质的氨基酸有偏差时，造成测定误差；操作过程繁琐，对操作者的技术熟练程度要求高。 2.双缩脲法测定蛋白质含量 3. Lowry法 4.紫外光吸收法 （1）原理：蛋白质中的芳香族氨基酸的共轭双键，使蛋白质在280nm有一个吸收峰，可根据吸收值推算蛋白质含量。 相对纯化的、无核酸污染的蛋白质的紫外吸收比值（A280/A260）约为1.8，如此值过低，表明有较多的的核酸杂质存在。 （2）紫外光吸收法的优缺点 优点：简便，样品不损失，测定后可继续使用。 缺点：精确度差。 （3）用途 在蛋白质纯化过程，尤其是各种色谱纯化过程中监测蛋白质的位置，判断吸附和洗脱情况。 5.考马斯亮蓝染色法 （1）原理：考马斯亮蓝G-250在一定浓度的乙醇和酸性溶液中，呈现红色。在此溶液下，考马斯亮蓝G-250可以与蛋白质结合，并导致考马斯亮蓝G-250的颜色从红色变为兰色，最大吸收峰从465nm移至595nm。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的复合物在595nm波长处具有很高的光吸收，并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。 （2）考马斯亮蓝染色法的优缺点 优点：操作简便；灵敏度高于Lowry法；考马斯亮蓝G-250与蛋白质 的复合物颜色稳定。 缺点：要求样品完全溶解；样品不能回收使用。 （二）其他蛋白质定性定量分析技术 免疫印迹法（Western blotting）是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。印迹技术最初是用于核酸的分子检测，后来人们发现，蛋白质在电泳分离之后也可以转移并固定与膜上，相对应于 DNA的Southern blotting 和RNA的Northern blotting ,该印迹方法亦被称为Western blotting。由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为免疫印迹技术（immunoblotting ）。 3. 超离心法 沉降系数：溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S（Svedberg）表示： 1S =1×10-13秒 蛋白质相对分子量： R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 v：偏微比容 ρ：溶剂密度 S = dx / dt ω2 x M= RTS D(1 – vρ) 4. 凝胶过滤法 凝胶过滤也称凝胶层析、分子筛层析， 它是依据样品物质分子大小这一物理性质进行分离分析的方法。 分子筛效应：不同大小的分子在网状凝胶中，大分子走的路径短、小分子走的路径长。 相对分子量的对数值 1-氯-2.3-环氧丙烷 葡聚糖凝胶的形成 5. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 ? 2比例结合。 每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。 由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。 用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。 1. 根据分子大小不同的分离方法 （1）透析(dialysis)和超滤 （2）密度梯度离心 蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后在离心管中（常用塑料的）被分离成各自独立的区带。 常用密度梯度：蔗糖密度梯度 （3）凝胶过滤 前面已述 2. 利用溶解度的差异的分离方法 （1）等电点沉淀和pH控制 蛋白质在等电点溶解度最小 （2）蛋白质盐析 高浓度中性盐，破坏蛋白质水化层，中和表面电荷而发生沉淀，称盐析。 不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。 （3）盐溶 低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称盐溶。 蛋白质通过离子键吸引在一起，而降低其溶解度；尤其当蛋白质溶在与其