HRM甲基化位点检测灵敏性.doc

HRM甲基化位点检测的灵敏性 ??点击次数：142??发布日期：2010-10-12??来源：本站??仅供参考，谢绝转载，否则责任自负 利用LightScanner上的高分辨熔解曲线进行DNA甲基化位点检测的灵敏性 引言 DNA甲基化是一种重要的表观遗传CpG二核苷酸修饰形式，异常的DNA甲基化模式发生在许多基因启动子的CpG岛，这会增加患癌症的风险。CpG岛高甲基化常导致基因沉默，与癌症、老化、基因印记、X-染色体失活密切相关，此外，全基因组CpG高甲基化中也证实了发生在肿瘤形成的早期。传统的检测甲基化位点的方法是通过重亚硫酸盐处理，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后进行直接测序。甲基化的胞嘧啶没有发生改变，因此通过测序很容易识别。本研究中我们系统的评价了通过LightScanner的高分辨溶解曲线检测甲基化的可靠性。如果这种方法在检测甲基化中是可靠且灵敏度高，就可以减少测序的繁琐过程。 未处理的和经过SssI处理的pBluescript II SK(+)质粒用Qiagen EpiTect试剂盒进行重亚硫酸盐。通过对有代表性的区域进行测序，确保样品完全甲基化以及亚硫酸盐处理。引物设计在扩增片段大小在79-216bp的含有1-8个CpG位点的7个不同的片段。100%甲基化的和未甲基化的样品按50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%的比例混合，100%甲基化的和未甲基化的样品可以明显的区分开。当两个样品按以上比例混合后，熔解曲线表现出重复的剂量放映关系，当50%混合时与未甲基化的标准品偏性最大。高分辨溶解曲线的灵敏度足够检测甲基化位点，对小片段的灵敏度可达到2%,大片段的可以10%。 重要的DNA甲基化位点显示在B淋巴细胞增生性疾病，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）中。瘤抑制基因的外部沉默可以通过DNA甲基化抑制剂处理而发生转变。本研究中，CLL患者的miR-195基因CpG岛上游甲基化位点用Vidaza或Cladribine处理，重亚硫酸盐处理的CpG甲基化变化的最高的进行PCR扩增，之后用LightScanner进行高分辨溶解曲线分析。样品经亚硫酸盐处理后有不同的的胞嘧啶的转换，然后通过单独和混合后分析检测的灵敏性。不同克隆之间只要有意个被保留的C就可以在异源或同源混合的样品中区分开。这一结果证实了高分辨熔解曲线是检测甲基化位点的简单且灵敏度高的方法。 图1：使用Sssl甲基化酶使2.9Kb的pBluescript CpG甲基化。甲基化的和非甲基化的样品都使用Qiagen EpiTect Kit进行重亚硫酸盐处理，之后进行PCR扩增，Lightscanner检测，最后通过测序验证。 图1A：重亚硫酸盐处理的100%甲基化的和100%非甲基化的四个片段。 图1B：79-216bp的有2-8个CpG位点的甲基化的和非甲基化的片段进行不同比例的混合。对CpG较少的小片段的检测的灵敏度在2%，有较多CpGs的大片段的检测的灵敏度在10%。 图1C：包含一个CpG位点的110bp，甲基化和非甲基化的样品按不同比例混合。（8个重复） 图2：甲基化抑制剂处理患者CpG岛 下图为用甲基抑制剂Vidaza或Cladribine处理前后microRNA195（269bp）的上游CpG岛甲基化位点的变化 图3：miR-195 CpG岛的269bp扩增区 两个不同的病人的CpG位点见下表 图4：miR-195 CpG岛的150bp扩增区 ? 图5：从4个CLL患者中克隆miR-195可能调控区，使用Qiagen EpiTect Kit进行重亚硫酸盐处理，之后PCR扩增，Lightscanner检测，测序。不同的患者采取不同的甲基化模式扩增（0-8 Cs）。熔解曲线是含有18 CpG位点的269bp的片段（A）和含有5 CpG位点的150bp的片段（B）。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 图6：等量混合不同患者的进行不同甲基化模式的克隆，并扩增了含有5CpG的150bp的片段。使用甲基抑制剂处理前后进行甲基化和未甲基化控制的比较，熔解曲线分别为患者P3（A），P4（B），V1（C），V3（D）。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 图7：甲基化的和非甲基化的DNA样品按不同的比例混合，150bp的片段含有5和CpG位点。 总结 用不同的DNA甲基化模式来评价LightScanner 高分辨熔解曲线的能力。用质粒控制含100%甲基化的和未甲基化的部分表现出一定的剂量关系，50%混合后与未甲基化的偏离程度最大。分析结果证明对小片段的甲基化检测的灵敏度在2%，大片段的灵敏度在10%。 在CLL分析中，经过甲基抑制剂处理