菌落PCR转化子的筛选.ppt

转化子的筛选 ——菌落PCR DNA克隆的过程 获得目的DNA片断 (提取质粒DNA、PCR、酶切） 载体DNA与目的基因连接 转化受体细胞 筛选转化子 表达目的基因 连接反应后，可形成多种类型的DNA分子1.不带外源DNA的载体自连分子2.外源DNA彼此相连的多聚DNA分子3.载体与外源DNA相连的分子 通过筛选鉴定： 1.有没有外源DNA 2.外源DNA的连接方式是否正确 重组子筛选方法 遗传检测法 物理检测法 菌落原位杂交法 免疫化学检测法 测序 菌落PCR 遗传检测法 （1）抗药性记号插入失活选择法 （2） β-半乳糖苷酶显色法筛选重组子 菌落原位杂交 提取质粒酶切法需要提取质粒,当筛选的样品较多时,操作比较繁琐； 蓝白斑筛选法需要载体有特殊结构; 杂交筛选法除操作比较复杂外,尚需使用同位素;插入失活法仅适用于个别载体。 本次实验中抗性平板上生长菌落数量众多，采用一种快速、简便的筛选方法——菌落PCR 菌落PCR ：是直接以转化菌的单个克隆为模板,通过特异性引物或通用引物对插入载体中的目的基因快速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。 与传统的鉴定方法相比,由于其具有快速、经济、简便的特点而被广泛用于转化菌、特别是大量转化子的鉴定和筛选 。 操作步骤 在PCR管中加7.5μL无菌水。 为平板上将要挑取的菌落标上号码（每组挑取8个菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙签点在LB(+Amp)平板，记录号码。 在PCR管中加7.5μL PCR pre-Mix（已配好） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。 菌落PCR和常规PCR的比较 菌落PCR： 常规PCR： 94℃ 10min 94℃ 5min 94℃ 40s 94℃ 40s 62℃ 32s 58℃ 32s 72℃ 90s 72℃ 90s 30～35 cycle 35～40 cycle 72℃ 7min 72℃ 7min 4℃ for ever 4℃ for ever 前变性94℃时间延长为10 min, 使得细菌能够充分破裂,DNA 大量释放并充分变性。 退火温度由 58℃ 提高到62℃ 是由于原来引物中的酶切位点和保护碱基与待扩增的基因是不配对的，现在配对的数量增多，退火温度越高,特异性越强 。 循环次数减少是因为25～35个循环的扩增量足够进行检测，如果量太大跑出的电泳条带呈现︼型，不易确定分子量。 菌落PCR出现假阳性 转化时未进入菌体内的小片段DNA存在于受体菌上或涂溅在抗性平板菌落周边上。样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东西。 菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物理原因（变性、退火的温度、时间）。 一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽,形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带,多数不太亮,条带细而且不规则,有时拖尾 设阴性对照 菌落PCR完毕后电泳检测带型，在LB平板上挑选有正确带型的菌落。 阳性克隆提取质粒 酶切检测条带的分子量 测序，检查点突变 * * *