体外培养小鼠生精细胞的形态学研究.pdf

体外培养小鼠生精细胞的形态学研究1 江中良，李青旺，张明涛，李文烨，帅春晓，程磊 西北农林科技大学动物科技学院 11＃ 陕西 杨凌 712100 E-mail：jiangzhongliang73@y 摘 要：利用姬姆萨原液和瑞－姬染色法对30-35 日龄小鼠精液和睾丸组织培养后的生精细 胞和精子进行形态学鉴定。结果表明，用姬姆萨原液染色精子形态清晰，细胞膜边缘清楚， 呈紫红色，未成熟精子的染色程度浅于成熟精子；另外，姬姆萨原液也可以替代其它混合染 料。睾丸组织经培养后，用姬姆萨原液染色，生精细胞形态清晰，细胞核呈颗粒状，开始呈 现深紫红色，胞质粉红色且带有蓝色背景，颜色较深，过一定时间后，颜色变浅；瑞－姬染 色生精细胞形态完整清晰，细胞核、核仁、胞质分别呈现不同颜色。 关键词：生精细胞；体外培养；形态学；细精管 生精细胞包括精原细胞、各级精母细胞和精子细胞，其中精原细胞包括Ａ型精原细胞和 Ｂ型精原细胞，前者作为人体内唯一可自我更新的干细胞，逐渐受到科学家的重视[1－3] 。而 Ａ型精原细胞发育成为成熟精子的过程仍存在许多问题，包括精子发生的基因调控，精原细 胞增殖分化的启动和调控，干细胞状态的维持及自我更新的方式等[4，5] 。生精细胞培养可用 于人类男性生殖生理及精子发生，调控机制及治疗精子发生阻滞的患者；对精子发生机制的 进一步阐明；可促进各种类型的精子微注射[6]，也可以促进动物转基因技术的发展及珍稀野 生动物繁殖和濒危物种的保护[7]等。随着细胞培养技术的发展，人们可直接对所培养的细胞 进行观察处理。因此，生精细胞体外成熟培养的研究已越来越重要，各国学者为之作了大量 的努力。本研究通过对小鼠精液、细精管中生精细胞和精子的染色，及细精管组织培养方面 的研究，以期为今后的应用提供一定的数据和理论基础。 1.材料和方法： 1.1 实验动物选择 小白鼠购自第四军医大学实验动物中心，昆明系30-35 日龄，健康状况良好，生殖系统 发育成熟。 1.2 仪器、设备与试剂 电子天平（上海精密科学仪器有限公司），相差显微镜及显微镜温控仪 （南京凯尔医疗 器械有限公司），恒温室水浴锅，CO2培养箱等。 DMEM ，谷胺酰胺（GIBCO ），新生牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所），PBS ， D-Hankes，Vc （天津市登峰化学试剂厂），注射用青霉素钠（哈药集团制药总厂），注射用 硫酸链霉素（大连美罗大药厂），瑞－姬染液，三蒸水等。 1基金项目：西北农林科技大学青年专项基金：小鼠生精细胞体外成熟培养（05ZR104 ）。 -1- 1.3 PBS 液与培养液 PBS液由KCl 0.2043g，KH PO 0.2019g，NaCl 8.0g，Na HPO .12H O 2.8620g配成，用 2 4 2 4 2 三蒸水定容至 1000ml ；生精细胞培养液由谷胺酰胺 36mg，Vc0.1g，青霉素 100 单位/ml， 链霉素 100IU/ml，新生牛血清 10ml配成，DMEM定容至 100ml 。 1.4 染色液 姬姆萨原液配制：取姬姆萨染料 1g，甘油 66ml，甲醇 66ml，先将姬姆萨染料置于研钵 中，加入少量甘油后仔细研磨 30min，再将全部甘油 （60℃）倒入混匀，置 60℃恒温中继续 溶解 2h ，然后加入 60℃的甲醇，混匀后密封保存于棕色瓶中，两周后使用。 磷酸盐缓冲液配制：取Na HPO .12H O 2.25g及NaH PO .2H O 0.55g置于 100ml容量瓶 2 3 2 2 3 2 中，加入 30 ml蒸馏水，摇匀，三蒸水定容至 100ml （现用现配）。 瑞－姬染液：按姬姆萨染液 30%，瑞士染液 70%混合而成。 1.5 生