固定化葡萄糖氧化酶活性的X射线微区分析.pdf

维普资讯 第 29卷 分析化学 (FENX1HUL／XL~) 研究简报 第 l2期 2001年 12月 ChineseJoum AnalyticalChe~sw 1434一I436 固定化葡萄糖氧化酶活性的x射线微区分析 黄永章 姚子华’ 王桂华 仇满德 (河北大学理化分析 中心，保定 071002) 摘 要 利用X射线檄区分析方法．对固定化活性葡萄糖氧化酶进行了定位分析；葡萄糖作为底物，FeSOj和 Ⅺ作为捕捉剂，底物经固定化葡萄糖氧化酶催化产生 H_ ．后者和捕捉剂反应生成沉淀，可 确定固定化葡 萄糖氧化酶的催化活性部位。结果表明：颗粒越小，酶活越高，活性葡萄糖氧化酶在凝胶 内分布均匀，且绝大 多数葡萄糖氧化酶固定在凝胶的内部。作者还研究了固定化活性葡萄糖氧化酶定位的最佳条件 关键词 x射线微区分析，固定化葡萄糖氧化酶，活性 1 引 言 固定化葡萄糖氧化酶的研究长期以来是倍受关注的研究课题 “。。包埋固化法 “是一种常用的方 法，该方法把酶定位于聚合物材料或膜的格子结构中，这样可防止酶蛋白释放。由于酶和载体间没有结 合作用，故酶活性高。如果能对固定化活性葡萄糖氧化酶进行定位，清晰地确定凝胶中活性葡萄糖氧化 酶的分布，将有助于葡萄糖氧化酶的固定化研究 固定化酶进行话性定位的基本原理是 ： 醢 底物— 产物 +捕获剂(金属离子 卜一 活性部位沉淀 利用聚焦电子束对固定化酶表面进行激发，有活性的部位发射出沉淀金属的特征 x射线，通过 x 射线能谱分析即可定位酶的活性部位 。本工作研究了利用x射线微区分析对凝胶 中活性葡萄糖氧化 酶定位的可能性和最佳定位条件 ．并对凝胶粒径大小与固定化葡萄糖氧化酶酶活性的关系进行了研究。 2 实验部分 2．1 材料及仪器 KYKY一1000B扫描电镜(附 ．5400X射线能谱仪)；s(Li1探测器(Be窗厚 7．6 Ⅱn；测量范围NaU)； 含不同量的葡萄糖氧化酶及不同颗粒的固定化葡萄糖氧化酶(自制)．葡萄糖为分析纯及 Ⅺ(10 L)和 FeSO4(10 L)水溶液，葡萄糖氧化酶(GOD)为日本To~．obo公司产品(122uhng)。 2．2 酶的固定化 本文采用溶胶凝胶技术 制备了固定化葡萄糖氧化酶。用研磨方法获得不同粒径的固定化葡萄糖 氧化酶。 2．3 固定化葡萄糖氯化酶的孵育 向50rIlL的小烧杯中加入O．Imol／L醋酸缓冲溶液(pH=5．6)5mL，KI和 FeS04各 10mg．再加入葡 萄糖0．9g以及固定化葡萄糖氧化酶0．01g，水浴孵育 1h后，将固定化葡萄糖氧化酶滤出，用蒸馏水漂 洗干净 。 2．4 固定化葡萄糖氧化酶的对照实验 除了孵育液中未加入葡萄糖外，其余所加试剂和操作与2．3相同。 2．5 不同条件下固定化葡萄糖氧化酶的孵育 改变孵育液中一种试剂的加入量，其余试剂的量不变，操作与2．3相同。 20014J[~6Il5祷【；20014~．13接受 维普资讯 第 12期 黄永章等：固定化葡萄糖氧化酶活性的x射线微区分析 2．6 x射线微区分析 将制备好的试样用 SEM进行形貌观察。对上述样品随机采集 6次X射线能谱，得到对应谱 图。利 用IN．540O图像处理系统的 PP程序分别对上述样品进行Fe元素的X射线面分布采集。 3 结果与讨论 3．1 固定化GOD与捕捉剂的反应 图1a上没有 Fe峰出现，说明固定化COD不与捕捉刘发生作用．从而排除了捕捉剂对固定化 COD 的干扰。图 lb中有明显的Fe峰出现，这是因为：在消除了上述干扰的情况下，葡萄糖在固定化 GOD作 ： 日 芎 i l { i § 篓