1 第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同.ppt

现代生物学实验技术 实验一IEF/SDS—聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 实验原理 聚丙烯酰胺双向电泳是一种由任意两个单向聚丙烯酰胺电泳组 合而成的，在第一向电泳后再与第一向垂直的方向上进行第二 向电泳的分离方法。其基本原理是第一项基于蛋白质的等电点 不同在pH梯度胶内等电聚焦(Isoelectricfocusing )；第二项 则根据分子量的不同大小进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分离,把复杂蛋白质混 合物中的蛋白质在二维平面上分开。经过电荷和质量两次分离 后,可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。 IEF/SDS双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在 1975年根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。 采用IEF/SDS分离蛋蛋白质，第一向IEF/SDS所 用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状，第二向SDS所用的为 板状。IEF/SDS与IEF和SDS的区别在于： 1. 第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第 一向IEF时，为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与 SDS结合以利于第二向SDS的进一步分离，必须在第一 向电泳系统内加入高浓度的尿素和适量的的非离子去污剂NP- 40，而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两种试剂外还含 有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷，不影响各蛋 白质原有的电荷量和等电点，其作用在于破坏蛋白质分子内的 二硫键，促使蛋白质变性和肽链舒展，从而有利于蛋白质分子 在较为温和的条件下与SDS充分结合。 2. 第二向的加样操作与相应的单向电泳不同。经过第一向 IEF，蛋白质在第一向的凝胶柱内得到了初步的分离。 在进行第二向SDS-PAG时，其加样方式是将第一向电泳后的凝 胶柱包埋在第二向的凝胶板内，通常包埋于凝胶板的上端。由 于第二向的电泳分离系统不同于第一向，因此必须将第一向电 泳后的凝胶柱在包埋于第二向凝胶板之前，预先在第二向的电 泳分离系统内进行震荡平衡。所用的平衡液通常与单向SDS- PAG所用的蛋白质样品处理液相一致，内含?-巯基乙醇和SDS 等。经过震荡平衡，凝胶柱内原有的第一向分离系统被第二向 的电泳分离系统所取代。其中?-巯基乙醇使蛋白质组分分子的 二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质充分结合，从而完 成第二向SDS的样品处理，即可进行第二向电泳。 二. 实验步骤 蛋白质提取：称取1-1g水稻幼苗或200粒水稻胚，用5ml 0.1mol/L的 Tris- HCl提取液(内含2 mmol/L二硫苏糖醇、2 mmol/L抗坏血酸、2 mmol/L 半胱氨 酸、 5 mmol/L EDTA、2% ?-巯基乙醇， pH8.8 )充分研磨，12000g离心10 min，测定上清液的蛋白质含量 ，加入10倍体积的预冷丙酮 ，置-20℃ 下沉 淀2-3h，4℃，12000 g离心20 min，沉淀用适量的样品裂解液溶解，蛋白质 含量控制在15-20?g/?l ，-20℃下保存备用。 １．试剂配制： 第一向试剂： 1）样品裂解液（内含9.5mol/L尿素、2%非离子型去污剂NP-40、0.8% Ampholine pH5-7、0.8%Ampholine pH6-8、0.4%Ampholine pH3.5-10、2%二 硫苏糖醇、5 mmol/L K2CO3）：取5.7g新鲜尿素，2ml 10%非离子型去污剂NP- 40，0.2ml Ampholine pH5-7，0.2ml Ampholine pH6-8，0.1ml Ampholine pH3.5-10，0.2g二硫苏糖醇（DTT），1ml 50mmol/L K2CO3，用双蒸水定容到 10ml。用eppendorf 管分装，每管100?l，置于－20℃冰箱保存。 2） 第一向凝胶储备液（含28.38%丙烯酰胺、1.62%甲叉双丙烯 酰胺）：取7.09g丙烯酰胺溶于双蒸水后加入0.405g甲叉双丙烯 酰胺。待溶解完全后定容至25ml，置于棕色瓶内于， 4℃冰箱 保存。 3） 第一向电极母液（临用前稀释10倍）： 正电极母液（0.1mol磷酸）：取6.75ml磷酸，用去离子水定 容至1000ml。 负电极母掖（0.2mol NaOH）：取16g NaOH，用去离子水定 容至2000ml。 4）样品覆盖掖（含8.0mol/L尿素、0.4% Ampholine pH5-7、 0.4% Ampholine pH6-8、0.4% Ampholine pH3.5-10、5mmol/L K2CO3）：取新鲜尿素4.8g，0.1ml Ampholine pH5-7，0.1ml Ampholine pH6-8，0.1ml Ampholine pH3.5-10，1ml 50mmol/L K2C