第六章 酶分离纯化-3.ppt

The Extraction, Separation and Purification of Enzyme;酶的提取、分离纯化技术路线; 酶的组合分离纯化策略;酶分离纯化的基本原则;酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，;2、细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎;机械破碎;酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 ;盐提取（改变离子强度）;在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 ; 原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。;B、有机溶剂沉淀（降低介电常数）;有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低; 优缺点： 优点： 1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点： 1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 ;5. 酶的纯化与精制;2）凝胶过滤;3）透析与超滤 ; 超滤原理的示意图 ;根据酶分子电荷性质的分离方法 1）离子交换层析;FLASH;2）电泳;3）等电聚焦电泳;4、利用生物分子专一性结合的 分离方法; 原理：把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类表面的功能基，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上时，而其它的蛋白质则因对该配体无特异的结合部位而不被吸附，它们通过洗涤可除去，被特异结合蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。;亲和层析：