修回稿稿号200803017 - 第三军医大学学报.doc

修回稿 稿号200803017 JNK3腺病毒促进人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的研究 韩 卿1，宋方洲1，易发平1，卜友泉1，王治东2，李长燕2，杨晓明2（1重庆医科大学：生物化学与分子生物学教研室，临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室，重庆 400016；2北京放射医学研究所，北京100850） 摘 要：目的：构建人JNK3基因重组腺病毒，检测其对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖的影响；以表阿霉素作为凋亡诱导剂，检测其对细胞凋亡的影响。以pDBLeu-JNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长，构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-JNK3，线性化后与骨架载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组，在HEK293细胞中进行病毒包装和扩增，经PCR方法鉴定后，用包装后的病毒上清感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，Western Blot方法检测JNK3蛋白的表达；MTT实验检测其对细胞增殖的影响；流式细胞术检测表阿霉素诱导的细胞凋亡。核酸测序和PCR鉴定表明成功构建Ad-JNK3，终点稀释试验测定扩增的腺病毒滴度为6.5×1010 pfu/ml；Ad-JNK3在SH-SY5Y细胞中表达JNK3蛋白；MTT检测表明Ad-JNK3可抑制SH-SY5Y细胞生长，抑制率为21.37%；流式细胞术表明Ad-JNK3可明显促进表阿霉素诱导的细胞凋亡。重组腺病毒Ad-JNK3能显著抑制SH-SY5Y细胞增殖，促进表阿霉素诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，为研究JNK3的作用机制及将其用于神经母细胞瘤的基因治疗提供了条件。 JNK3；重组腺病毒；表阿霉素；人神经母细胞瘤；细胞凋亡 R739.4； R73-36 A 基金项目：国家自然科学基金项目 作者简介：韩 卿，女，河北辛集人，博士研究生，主要从事分子生物学和信号转导方面研究。Email：hqcq2008@163.com 通讯作者：宋方洲：(023-mail：fzsongcq@163.com recombinant adenovirus promote human neuroblastoma SH-SY5Y cells apoptosis HAN Qing1, SONG Fang-zhou1, YI Fa-ping1, BU You-quan1, WANG Zhi-dong2, LI Chang-yan2, YANG Xiao-ming2 1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Key Laboratory of Clinical Laboratory Diagnostics of Ministry of Education, Chongqing Medical University, Chongqing 4000l6; 2Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850 Abstract：Objective To construct recombinant JNK3 adenovirus to study its function on the proliferation of human neuroblatoma SH-SY5Y cells; use Epirubicin as apoptosis inductor to research its effect on apoptosis. Methods The full-length JNK3 cDNA fragment was amplified by PCR from the pDBLeu-JNK3 plasmid to construct the shuttle plasmid pAdTrack-CMV-JNK3. Then the linearized shuttle plasmid was co-transformed into BJ5183 bacteria with backbone vector pAdEasy-1 to obtain the recombinant adenoviral plasmid pAd-JNK3 by homologous recombination. The linearized recombined adenovirus pAd-JNK3 was transfected into HEK293 cells for packing and amplification. Viral titers were measured by endpoi