第9章 核酸分子杂交技术与应用.ppt

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第9章 核酸分子杂交技术与应用

第九章 核酸分子杂交技术与应用 第一节 核酸分子杂交的基本原理与分类 定义:单链核酸分子在合适的温度和离子强度下,通过碱基互补形成双链杂交体(hybrid)的一类技术,称作核酸分子杂交。 一、核酸分子杂交的基本原理 变性:融解,双螺旋氢键断裂,形成单链; 复性:单链探针与靶DNA单链之间形成杂合体DNA(异源核酸分子),即为核酸杂交。 二、核酸分子杂交分类 (一)按分子: DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交 (二)按标记: 同位素与非同位素杂交 (三)按介质: 液相杂交、固相杂交、原位杂交 (四)基因芯片技术 固相杂交 1、菌落杂交:筛选重组菌落 2、Southern杂交:(靶核酸是DNA) 3、Northern杂交:(靶核酸是RNA) 4、点杂交和狭缝杂交 第二节 杂交反应的影响因素 一、长探针杂交 (一)影响杂交速率及杂化分子稳定性: ◆核酸分子浓度: 浓度↗,杂交速率↗,本底和非特异杂交↗. ◆碱基组成: G+C含量↗,杂交速率↗,影响杂化分子Tm。 ◆盐溶液的浓度: 浓度↗,杂交速率↗,稳定性↗. ◆温度: 低于Tm20Co-30Co时,温度↗,杂交速率↗. ◆其他: 甲醛、碱基错配比例、加速剂等. (二)酶联对探针及杂交的影响: (三)杂交反应体积: (四)杂交的时间: 二、短小寡核苷酸探针杂交 (一)影响杂交稳定性的因素: 1、融解温度(Tm): 50%杂化核酸分子解链温度。 (胺盐、碱基错配比例) 2、盐浓度 (二)杂交时间: 依复杂性,一种或多种探针 (三)杂交加速剂: 一般不用 (四)洗脱条件 (五)杂交条件的优化:杂交或洗脱温度盐浓度 第三节 探针的设计(1) 一、探针的种类: DNA、RNA、寡核苷酸探针 (一)DNA探针:单链、双链 不易被降解 (二)RNA探针:效率高、易被降解 (三)寡核苷酸(ASO)探针:可大量合成 第三节 探针的设计(2) 二、探针标记方法的选择: ●放射性标记:32P ●非放射性标记:生物素、地高辛、荧光素 三、探针的长度: ●DNA、RNA探针:400-500bp ●寡核苷酸探针长度:F=(1/4)L×2N 。 第四节 核酸分子与固相介质的结合 一、支持介质的类型: 硝酸纤维素薄膜(NC)、尼龙膜等。 二、靶核酸分子的转移: 1、从克隆菌落转移DNA 2、从凝胶胶上转移DNA ●毛细转移: 毛细管虹吸(Southern印迹) ●真空转移: 三、核酸的固定: 烘烤、紫外光固定、碱固定。 第五节 探针的标记 一、全程标记: ◎随机引物法; ◎DNA切口平移标记法; ◎全程RNA标记; ◎化学法全程核酸标记。 二、末端标记: ◎5′末端标记; ◎3′末端标记。 第六节 杂交与杂交后检测(1) 一、杂交 ◆预杂交: 目的是封闭可能发生非特异性杂交的部位----降低本底。 ◆杂交:探针与靶序列孵育。 ◆洗脱:目的是洗脱未特异性杂交的探针。 第六节 杂交与杂交后检测(2) 二、杂交标记物信号的检测: (一)放射自显影 (二)非放射性标记的检测 1、直接检测:显色反应、化学发光 2、间接检测: ELISA、多探针检测、化学发光物检测。 三、滤膜和探针的重复使用 第七节 核酸分子杂交方法评价及应用 一、斑点/狭缝杂交方法的评价及应用 二、Southern杂交方法的评价及应用 三、Northern杂交方法的评价及应用 四、原位杂交方法的评价及应用 本章总结 1、核酸分子杂交: 单链探针与靶DNA单链之间形成杂合体DNA(异源核酸分子),即为核酸杂交。 2、基本原理: 变性(融解)、复性 3、核酸分子杂交分类 ●按分子: DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交 ●按标记: 同位素与非同位素杂交 ●按介质: 液相杂交、固相杂交、原位杂交 4、探针的设计 ●探针的种类: DNA、RNA、寡核苷酸探针 ●探针标记方法: 放射性标记、非放射性标记 5、杂交: 预杂交、杂交、洗脱。 6、Southern、Northern杂交方法的应用 作业 1、试述核酸分子杂交技术的原理及过程 2、简述探针的种类和标记方法 * * 李建平 原位杂交: 切片组织细胞中基因定位. *

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