1个遗传性血小板无力症家系临床表型及发病机理探究.doc

1个遗传性血小板无力症家系临床表型及发病机理探究【摘要】目的 对1个遗传性血小板无力症（GT）家系进行临床特征分析及基因突变检测以探索疾病的发病机制。方法 通过出血病史、家族史、止血和凝血指标检测、血小板聚集实验和流式细胞术检测血小板表面整合素αⅡbβ3表达情况明确1个GT家系的诊断，并用PCR 扩增结合直接测序法分析先证者及家系成员的整合素αⅡb基因和β3基因的所有外显子及其侧翼序列，突变位点经检索SNP数据库及查找相关文献排除多态性可能。结果 1个GT家系先证者血小板计数正常，凝血象正常，血小板对诱导剂ADP反应低下，而对诱导剂瑞斯托霉素反应基本正常；流式细胞术结果显示:先证者1为变异型GT，基因分析共发现1纯合突变:发生在β3基因的突变有2种，分别为1199GA(400CysTyr)。结论 β3 1199GA纯合突变是家系1先证者发生GT的原因，这是国内首次报道此位点突变。 【关键词】血小板无力症 整合素GPIIb-IIIa 基因突变 出血 中图分类号：R55文献标识码：A文章编号：1005-0515（2011）1-054-03 血小板无力症（Glanzmann thrombasthenia,GT）是由于血小板膜表面整合素αⅡb/β3质和（或）量的缺陷所导致的一种常染色体隐性遗传性疾病，其特点为患者终身存在出血倾向[1]，患者的血小板对多种生理性诱聚剂反应低下或缺如。编码αⅡb亚基和β3亚基的基因均定位于17q21-23 共260 kb 的区域，二者紧密连锁，αⅡb基因长17.2 kb，含30 个外显子，β3基因长65 kb，含15 个外显子。αⅡb与β3基因突变将导致αⅡb和β3亚基结构异常，使αⅡb/β3复合物合成、转运、表达和（或）功能障碍，引起GT[2]。血小板膜表面糖蛋白αⅡb/β3是血小板表面最丰富的粘附蛋白，它是Ca2＋依赖性异二聚体，在血小板活化后可以结合纤维蛋白原和血管性血友病因子介导血小板的聚集，在正常止血中发挥作用，介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间的相互作用，它参与了身体中多种生理过程[3]。本次实验主要通过对明确诊断的5例GT先证者及家系突变点筛查，并探索其可能的发病机理。对于首次报道的基因突变通过检索单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms, SNP)数据库(http://www.ncbi.nlm. /SNP) 以排除基因多态性。 1 临床资料和方法 1.1 临床表现 1例有异常出血史明确诊断为GT患者，女性，14岁，先证者双亲为近亲婚配，家系中均无类似出血情况。患者出诊时以皮肤黏膜出血为主要表现，皮肤淤点瘀斑，鼻衄，牙龈出血，月经初潮后以月经过多为主要表现，而无肌肉关节出血。 1.2实验室诊断 1.2.1 筛选试验 血象、血凝指标及全血涂片观察血小板的形态。 1.2.2 确诊实验 ADP、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集实验。采集枸橼酸钠抗凝的全血，离心收集富含血小板血浆（PRP）及贫血小板血浆（PPP）,诱导剂ADP终浓度为2umol/L及瑞斯托霉素终浓度为1.25ug/ml，在血小板聚集仪上检测血小板最大聚集率。 流式细胞术检测血小板膜表面糖蛋白αⅡb/β3表达：采集肝素钠抗凝的全血，用CD41-FITC(SZ22)、CD61-FITC(SZ21)和FITC-CD42b（SZ2）单克隆抗体孵育后，流式细胞仪检测血小板表面CD41(αⅡb)、CD61(β3)及CD42b(αIb)表达，用以正常人血小板为对照，根据平均荧光强度计算αⅡb及β3表达量。 1.2.3 其他： 通过检测血浆凝血因子Ⅷ、血浆凝血因子Ⅸ、血管性血友病因子抗原及纤维蛋白原等试验排除出血性疾病。 1.2.4 确诊标准：参照阮长耿、王兆钺《现代血液病诊断治疗学》[4]。 1.3 基因诊断 1.3.1 αⅡbβ3基因分析 根据αⅡb（基因库（NG_008331.））及β3（基因库（NG_008332.））基因序列分别设计扩增αⅡb基因30个外显子和β3基因15个外显子及其侧翼序列的引物。扩增αⅡbβ3外显子应用Oligo 6引物合成软件合成,αⅡb基因分别合成16对引物，β3基因合成15对引物。使用Qiagen公司生产的DNA提取试剂盒提取先证者及其家系成员外周血细胞DNA。扩增体积：25ul，扩增条件为：94℃5 min，然后94℃变性60S，55―65℃退火30S，72℃延伸60s，33个循环后72℃10min延伸。PCR产物送华大测序公司直接测序，发现有突变的PCR产物经反复多次扩增测序验证。 1.3.2确定正常人群中基因多态性及突变 检索SNP数据库及相关文献排除现有的多态性