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Cx43对针灸治疗原发性痛经大鼠效应影响［摘 要］ 目的:观察沉默穴位局部缝隙连接蛋白（connexin43，Cx43)的表达对针刺效应的影响，探讨针刺治疗原发性痛经的机制。方法:以催产素造成大鼠原发性痛经模型，应用RNA干扰（RNAi）技术沉默穴位局部Cx43的表达。将50只SD雌性大鼠分为正常组（N）、模型组（M）、针刺组（A）、针刺+干扰组（A+I）、针刺+干扰对照组(A+IC)。应用RT-PCR方法检测大鼠子宫的催产素受体（oxytocin receptor, OTR）、加压素受体（vasopressin receptor, VPR）的mRNA表达情况；放免法和ELISA检测血浆中前列腺素E2（PGE2）和PGF2α的含量。结果:①A组和A+IC组的大鼠扭体次数（9.43±3.87，10.28±4.23）明显低于M组和A+I组(15.43±5.13，17.00±3.87),潜伏期(12.43±3.46，11.00±3.65) min高于M组(7.57±1.99) min和A+I组(8.43±2.57) min（P0.05）。④A组和A+IC组的PGE2升高，PGF2α降低，较M组差异有统计学意义（P0.05). (4) As compared with the group M, PGE2 level increased and PGF2α level decreased in the group A and the group A+IC (P0.05)。 2.2 穴位处Cx43 mRNA及蛋白表达 A+I组穴位处Cx43 mRNA及蛋白表达水平均低于N组，且差异有统计学意义（P0.05）,见图1和表2。其中RT-PCR显示Plasmid-Cx43-shRNA干扰Cx43效率为42.19%,Western Blot干扰效率为56.89%，说明局部高压注射Cx43特异性shRNA真核表达载体有效地沉默了穴位处Cx43的表达。 注：与正常组比较，1)P0.05）。 3 讨论 大鼠皮肤中存在Cx26、Cx31、Cx37、Cx43等缝隙连接蛋白，其中以Cx43、Cx26表达最多［8］。本课题组前期研究工作［4-5］也表明，经线上穴位处的缝隙连接蛋白Cx43的表达高于非穴位，缝隙连接蛋白及缝隙连接与经络高度相关，由缝隙连接介导的细胞间通讯可能在经络活动中起重要作用。因此，理论上下调Cx43水平可能改变Cx43信号传导通路而影响针刺效应。 近年来的研究表明，一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解。这种诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNAi。Olivier等［9］曾用T7RNA多聚酶体外转录获得大量短干扰RNA(SiRNAs)，并且发现在不同的哺乳动物细胞，这种SiRNAs能够引发并促进非外源性或内源性基因的静止。许多学者［10-11］研究在细胞内表达SiRNA从而引发基因沉默。通过质粒表达SiRNA同样可以抑制特定基因的表达。本实验针对大鼠Cx43 mRNA的特定序列，设计了siRNA干扰质粒Plasmid-Cx43-shRNA和阴性对照质粒Plasmid-Con-shRNA，RT-PCR及Western Blot结果显示P-Cx43-shRNA有效沉默了穴位处Cx43 mRNA及蛋白的表达效率。 导致原发性痛经主要有子宫和内分泌两方面的因素。①子宫因素：痛经时，子宫平滑肌剧烈收缩，子宫血管痉挛，血流减少，造成组织缺血缺氧，使子宫肌肉处于挛缩状态而发生疼痛。引起子宫过度收缩的因素有前列腺素（PG）、催产素（OT）和加压素（VP）等［12-13］。②内分泌因素：子宫合成和释放PG的增加是发生原发性痛经的主要原因［14-15］。在非妊娠子宫,子宫内膜合成的PGs主要为PGE2和PGF2α。PGF2α具有刺激子宫收缩、使子宫张力增高的作用；相反，PGE2抑制子宫收缩，使子宫松弛。研究［16］表明,痛经患者子宫内膜及经血中PGF2α的浓度显著高于对照组,痛经越严重的妇女,其经血中PGF2α水平就越高。本实验结果与此报道相似。高浓度的PGF2α作用于螺旋小动脉壁上的PGF2α受体,引起子宫平滑肌痉挛性收缩,导致子宫血流减少,子宫缺血、缺氧,酸性代谢产物堆积于肌层从而导致痛经［17］。OT和VP是导致痛经的另两种激素。PGF2α调控子宫内膜OT和VP的释放。痛经时，子宫内膜的OT和VP增加，引起子宫收缩加强、子宫血流减少［12，18］。 祖国医学认为原发性痛经的病机主要是气血运行不畅，瘀阻冲任，导致“不通则痛”，根据辨证取穴、循经取穴的原则，实验中选取“关元”“三阴交”“地机”穴。“经脉所过，主治所及”，关元为足三阴与任脉交会穴；三阴交为足三阴之交会