DNA甲基化抑制物对雌激素受体β在乳腺癌细胞中表达影响及意义.docVIP

DNA甲基化抑制物对雌激素受体β在乳腺癌细胞中表达影响及意义【摘要】目的：研究甲基化抑制物作用于乳腺癌细胞后对其ER－β表达的影响及意义。方法：抽取细胞总RNA，采用半定量逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测MCF－7与MDA－MB－231中ER－β的表达状况。在两种细胞中按作用浓度加入甲基化抑制药物5－AZA－CdR，反应一定时间后用RT－PCR的方法测定药物处理后ER－β的表达情况，分析影响及意义。结果：MCF－7的ER－β平均表达水平（0.54±0.44），药物处理后平均表达水平（0.76±0.53），较未经药物处理的细胞明显升高（P1.8者为理想,各取2 μl mRNA 做逆转录成cDNA。逆转录条件: 5×逆转录反应缓冲液 4 μl，10 mmol/ L dNTP 2 μl,Olig(DT)18primer 1 μl, RNA酶抑制剂(Ribolock Ribonnclease inhibitor) 1 μl, Aid 逆转录酶 1 μl，加无核酸酶水至终反应体系20 μl，70 ℃变性5分钟，37 ℃孵育5分钟,42 ℃ 60分钟，70 ℃ 10分钟。反应完毕后取出,冰上放置5分钟，将生成的cDNA 置于- 20 ℃保存。Primer-5设计引物参照文献设计合成，ER-β上游引物序列5’-TGCTCCTGGCAACTACTTCA-3’,下游引物序列5’-GACAGGAGCATCAGGAGGTT-3’。 内参照β－actin 上游引物：5’GGACCTGACTGACTACCTA 3’，下游引物: 5’TCATACTCCTGCTTGCTG 3’。在MDA－MB－231和MCF－7的培养瓶中按10ml培基各加入终浓度为5 Mm的5－AZA－CdR原液5μl使得培养瓶内的药物浓度为2.5 μmol/L，48小时后抽取药物干预后的细胞总RNA并将其逆转录成cDNA －20℃保存，方法同前。1.3 ER－β的PCR反应条件：95 ℃预变性5分钟, 95 ℃变性1分钟, 57 ℃退火1分钟,72 ℃延伸1分钟, 共35 循环, 72 ℃延伸10分钟。取目的基因和内参基因的PCR产物各4 μl与载样液混和后（按4∶1），分别加入2%琼脂糖凝胶电泳检测并照相保存,各目的基因扩增重复3~5次，取均值。在图像分析系统上观察分析，用平均吸光度乘以条带面积的值表示总的吸光度值，代表各基因的mRNA量。以目的基因与内参基因的A 值的比值表示ER－βmRNA的相对表达水平。 1.4 统计学方法：采用SPSS12.0.1软件进行统计学分析。ER-βmRNA表达水平采用独立样本t检验，以P0.05为差异有显著性。 2 结果 2.1 MCF－7的ER－β平均表达水平（0.54±0.44），药物处理后平均表达水平（0.76±0.53），较未经药物处理的细胞明显升高（P0.05）。见图1。 2．2 非雌激素受体依赖的MDA－MB－231，未用药物干预之前不表达ER－β，药物处理后ER－β出现表达，其表达的平均水平为（0.32±0.11），P0.05。见图2。 2.3 经5－AZA－CdR作为甲基化抑制剂对于乳腺癌细胞具有一定的抑制生长和杀伤作用。见图3。 2．4 在经5－AZA－CdR干预48小时后MCF－7和MDA－MB－231细胞均有部分形态改变或死亡。见图4。 2．5 乳腺癌细胞中用药物干预后ER-βmRNA的表达：见表1。用PCR电泳法显示的内参基因及目标基因：见图5。 3 讨论 既然某些特定生长相关基因的点突变和基因表达缺失与DNA 甲基化机制有关,那么修正基因的甲基化状态就有可能成为一新的肿瘤治疗途径[5]。乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤,早发现、早诊断具有重要意义。肿瘤相关基因启动子的高甲基化是恶性细胞的普遍现象,且常发生在肿瘤进程早期。目前这种现象已在许多类型恶性肿瘤中得到验证,有可能成为评估肿瘤风险、制定预防策略、获得早期诊断、跟踪肿瘤预后的指标及作为肿瘤化疗、抗内分泌治疗的生物学标志[6]。ER 能作为依赖雌激素的生长因子,如它能在ER 阴性细胞中恢复表达,就能通过其他抑制因子基因再表达从而达到抑制肿瘤细胞生长。因此，DNA 甲基化抑制物出现是乳腺癌治疗的又一前景[4]。DNA去甲基化可以诱导乳腺癌ER-β表达增强或再表达，对于提高乳腺癌的内分泌治疗疗效和指导新辅助化学治疗有重大意义。但DNA去甲基化恢复ER再表达的机制尚待进一步探讨。 参考文献： [1] Bord S，Hornor A，Beavan S，et al.Estrogenreceptorsalpha and beta are differentially expressed in develo