HPLC法测定人血浆中比阿培南浓度及其药动学探究.doc

HPLC法测定人血浆中比阿培南浓度及其药动学探究[摘要] 目的：建立人血浆中比阿培南的高效液相色谱检测方法。方法：色谱柱为Agilent ZORBAX Bonus-RP （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇和0.03%醋酸水溶液，采用梯度洗脱法；流速为1.00 ml/min；检测波长为300 nm，血浆样品处理选用5-羟基吲哚乙酸为内标，采用硫酸锌沉淀蛋白。结果：比阿培南在0.2～50.0 μg/ml范围内线性良好，HPLC测定定量下限为0.2 μg/ml，比阿培南和内标在血浆的保留时间分别为3.9 min和9.7 min，出峰迅速。比阿培南浓度分别为0.5、5.0和40.0 μg/ml，血浆样本回收率分别为101.8%、100.8%、100.4%；精密度试验日内和日间RSD均小于15%，稳定性试验结果表明血浆样品在样品处理过程中较稳定（RSD 2.1.5 给药方法 临床上本品采用的给药方式为静脉滴注，故本试验采用将注射用比阿培南，并用100 ml 氯化钠注射液稀释，静脉滴注，滴注时间为1.0 h。根据说明书，注射用比阿培南的正常临床治疗剂量为静脉滴注，一次300 mg，12 h一次。故本试验采用低剂量组单次静脉滴注150 mg；中剂量组单次静脉滴注300 mg，高剂量组单次静脉滴注600 mg。多次给药，每次300 mg，每日2次。 2.1.6 样品采集 2.1.6.1 单次给药 受试者于试验前1周和试验期内均勿饮用酒类和咖啡类饮料，并在试验开始前一天进入Ⅰ期临床试验病房，晚上统一清淡饮食。受试者给药间隔依取血速度而定，通常间隔5 min。于给药前0 h、开始给药后15.0、30.0、45.0、60.0 min，给药结束后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0 h取血；受试者取血顺序同给药顺序。受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床。 2.1.6.2 多次给药 中剂量组10名健康受试者在单次给药结束后，继续进行多次给药，给药剂量为300 mg/次（药液稀释方法同单次给药），每日2次，连续给药5 d，每次静脉滴注时间均为1 h（第5天只给药一次）。于第2、3、4、5天早给药前及第5天开始给药后15.0、30.0、45.0、60.0 min，给药结束后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0 h前臂静脉取血，每人4 ml，置于肝素试管中，分取血浆，于-20℃保存待测。受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床。多次给药后3 d对受试者进行体检复查。 2.2 实验结果 2.2.1 方法专属性 在本实验所采用的色谱条件下，注射用比阿培南的保留时间为3.9 min左右，内标保留时间为9.7 min左右。注射用比阿培南和内标峰形良好，无杂峰干扰测定。提示本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的注射用比阿培南的浓度，灵敏度较高。见图1。 2.2.2 标准曲线和线性范围 取1.5 ml塑料离心管数支，量取空白血浆200 μl，置于离心管中，分别精密加入不同浓度的的比阿培南标准液，旋涡混匀，配成含比阿培南的浓度分别为0.2、0.5、1.0、3.0、10.0、20.0、50.0 μg/ml的标准含药血浆，各血浆含0.1 mg/ml内标20 μl，按“2.1.3”项下血浆样品的处理方法操作，制备一条标准曲线，并同时做空白样品，进行HPLC-UV分析。记录色谱图，计算比阿培南的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f（f = As/Ai）。以峰面积比值f对血药浓度C作权重回归计算，得回归方程：f=0.001 9+0.163 8C（权重系数w=1/C），r=0.999 0，按上述条件测得比阿培南在血浆中的定量下限为0.2 μg/ml。 2.2.3 精密度与准确度 取1.5 ml塑料离心管数支，按“2.2.2”血浆中比阿培南标准曲线制备方法制备含比阿培南浓度分别为0.5、5.0、40.0 μg/ml的标准含药血浆（每个浓度做5份样品）及一条随行标准曲线，按“2.1.3”项下血浆样品的处理方法操作。每天做一批及一条随行标准曲线，连续做3 d，共3批，每批每个浓度做5份样品，记录色谱图，计算比阿培南峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天的标准曲线求得实测浓度，计算批内和批间精密度。见表1。 表1 血浆中比阿培南的精密度 2.2.4 加样回收率试验 取1.5 ml塑料离心管数支，加入空白血浆0.2 ml，旋涡混匀，配成含比阿培南的浓度分别为0.5、5.0、40.0 μg/ml的标准含药血浆，计算比阿培南加样回收率。见表2。 表2 比阿培南加样回收率试验（n=5）