MMPs-TIMPs在甲状腺乳头状癌细胞中表达及作用探究.docVIP

MMPs/TIMPs在甲状腺乳头状癌细胞中表达及作用探究[摘要]目的：探讨甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)患者癌细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和金属蛋白酶的组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)蛋白的表达水平，探讨MMPs/TIMPs与甲状腺乳头状癌发生、发展之间的相互关系。方法：应用ELISA方法检测甲状腺正常组织和乳头状癌癌细胞培养液中MMP-2、MMP-9以及TIMP-1、TIMP-2的分泌水平；采用MTS掺入试验检测在rhMMP-2或抗MMP-2中和抗体的作用下，甲状腺正常组织细胞和乳头状癌癌细胞增殖水平。结果：甲状腺乳头状癌癌细胞分泌MMP-2、MMP-9水平提高，而分泌TIMP-1、TIMP-2水平降低，MMPs与TIMPs的比值升高特别显著；MMP-2对甲状腺乳头状癌癌细胞有明显的促增殖作用，抗MMP-2单克隆抗体能明显地抑制癌细胞生长。结论：MMPs与TIMPs的比值有望作为预测甲状腺乳头状癌生长和转移的一项检测指标。 [关键词] 甲状腺乳头状癌（PTC）；基质金属蛋白酶（MMPs）；金属蛋白酶的组织抑制剂（TIMPs） [中图分类号]R736 [文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）05（c）-017-02 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是由20个锌依赖性细胞外或膜结合型蛋白酶成员组成的超家族，它们通过裂解蛋白结构的肽键，参与结缔组织的降解，基质细胞及肿瘤细胞都可分泌MMPs，其功能涉及正常组织的发育、创伤的修复及胚胎着床等生理过程以及肿瘤浸润和转移的病理过程[1]。人体内存在着天然的MMPs抑制剂――金属蛋白酶的组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)，包括TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4，对MMPs的活性起调节作用；正常情况下，MMPs与TIMPs在体内是平衡的，MMPs与TIMPs的失衡是导致疾病的一个重要原因[2]；本文就此探讨甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)细胞中MMPs及TIMPs的表达，分析其与甲状腺乳头状癌发生、发展及转移之间可能存在的关系。 1 材料与方法 1.1 培养细胞的制备 经病理证实的40例甲状腺乳头状癌患者的肿瘤标本和11例癌旁正常组织标本来自本院肿瘤科和病理科，其中26例发生淋巴结转移；在无菌条件下，取新鲜组织1 g置于300目尼龙网（下接25 ml烧杯），用眼科剪剪成浆状，再用刮刀轻搓组织，边搓边用pH7.4 PBS冲洗，直到组织搓完，收集到细胞用含有10%FBS(胎牛血清，tetus bovine serum)的RPMI1640培养液配制成106个/ml细胞悬液备用。 1.2 试剂 RPMI1640、DME培养基、以及胎牛血清均为美国GIBCO公司生产；rhMMP-2、抗MMP-2中和抗体为美国RD公司产品；鼠IgG1为美国Sigma公司产品；MMP-2、MMP-9 、TIMP-1以及TIMP-2的ELISA检测试剂为美国Oncogene公司产品；非放射性细胞增殖试验检测试剂盒为美国Promega公司产品。 1.3 细胞培养 甲状腺乳状癌细胞和正常组织细胞用含有10%FBS的RPMI1640培养基培养，在细胞生长处于对数生长期时，调整细胞浓度为1×105个/ml，加入到12孔细胞培养板中，培养72 h，收集培养上清液及细胞裂解液-80℃保存（检测时取其混合物离心取上清液）。 1.4 RhMMP-2、抗MMP-2中和抗体对肿瘤细胞增殖作用的影响 随机抽取备用癌细胞悬液15份和正常细胞悬液11份，调整细胞数为1×105个/ml，加入到96孔板中，同时分别加入诱导剂rhMMP-2、抗MMP-2中和抗体及其同种型对照鼠IgG1，使其终浓度分别为rhMMP-2（100 ng/ml）、抗MMP-2中和抗体(1 μg/ml)、mIgG(1 μg/ml)。37℃，5% CO2孵育箱培养72 h终止培养前3 h掺入MTS,继续培养,最后在酶标上以490 nm波长处读取光密度值,按公式计算细胞的增殖率。 严格按照ELISA试剂盒的说明检测混合物上清液中相应因子的含量，根据标准曲线得出相应因子浓度。 1.5 统计学分析 实验数据采用SSPS10.0软件进行分析，均数比较用t检验，率比较用χ2及Fisher精确检验。 2 结果 2