Treg-IL-10-IL-6对狼疮性肾炎影响.docVIP

Treg\IL-10\IL-6对狼疮性肾炎影响【摘要】目的 检测活动期、静止期狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）患者及正常人外周血IL-10、IL-6、CD4+CD25+CD127lo调节性T细胞（Tregs）水平，探讨Treg、IL-10 、IL-6对狼疮性肾炎的的影响。方法 采用三色荧光染色通过流式细胞仪(FCM)分析外周血中CD4+CD25+CD127lo细胞水平，用CBA 流式蛋白分析系统检测外周血中IL-10、IL-6水平。结果 1、活动期LN患者外周血Tregs低于静止期（P 1.2 排除标准 ①妇女妊娠或哺乳期患者；②SLE合并Scr176μ mol/L；③混合性结缔组织疾病等自身免疫性疾病；④合并有心、脑、造血系统、严重感染等并发症及其他严重原发病、精神病患者。 1.3 正常对照组 来自福建医科大学附属第一医院健康志愿者，经详细体检及理化等检查，评定无心、脑、肝、肾、肺和内分泌等主要器官系统的实质性病变，共21例，男6例，女15例，年龄23～44岁（26.7±4.59）。 1.4外周血调节性T细胞测定 1.4.1 标本采集 LN患者及正常体检者分别于清晨空腹抽取肝素抗凝血2ml(肝素浓度25U/ml)1管，促凝管2ml1管，所有标本均于采集后1h内处理分析。 1.4.2 实验试剂 FITC标记CD4、PE标记CD25、Alexa Fluor标记CD127 抗体，CBA试剂盒等均购自美国 BD公司。 1.4.3 CD4+CD25+CD127loT细的检测 1.4.3.1 清晨空腹抽取肝素抗凝血2ml(肝素浓度25U/ml)，用PBS液1:1稀释，取稀释后的血3ml缓慢加入3ml的淋巴分离液管中，2500r/min离心20min；离心完毕，收集中间层白色云雾状细胞，用2ml PBS液,振荡混匀，1200r/min离心5min， 弃上清液，再用2ml PBS液,振荡混匀，1200r/min离心5min后弃上清液； 1.4.3.2 用蒸馏水稀释Buffer液，比例为9：1，每管分别加入配制好Buffer液200ul，混匀，平分为两管，设其中一管为阴性管，并加入FITC标记的CD4抗体20μL，混合均匀；设另一管为阳性管，分别加入FITC标记的CD4抗体，PE标记的CD25抗体，Alexa Fluor标记的CD127抗体各20μL，混合均匀； 1.4.3.3 经上述步骤后完成单细胞悬液的制备和染色，避光静置15分钟，避光完毕后每管分别加入Buffer液400ul，上流式细胞仪检测。 分析过程如下（分析结果见附图）。 （1）以FSC为横坐标，侧向散射角(SSC)为纵坐标，将外周血单个核细胞分群，分为中性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞和细胞碎片，确定淋巴细胞群。 （2）在淋巴细胞中以CD4设门，将淋巴细胞分为CD4+T淋巴细胞和CD4-淋巴细胞，计算出CD4+T淋巴细胞占淋巴细胞的比例。 （3）在CD4+T淋巴细胞中，以CD25设门，计算出CD4+CD25+T淋巴细胞占CD4+T淋巴细胞的比例。 （4）在CD4+CD25+T淋巴细胞中，以CD25、CD127设门，计算出CD4+CD25+CD127loTreg占CD4+T淋巴细胞的比例。 注：R1：T lymphocytes； R2：CD4+T cells； R3：CD4+CD25+T cells R3：CD4+CD25+T cells 1.5IL-10、IL-6、IL-4、IL-2、TNF-α、IFN-γ测定 空腹血样离心后取血清于-20℃保存后统一检测。 1.5.1 标准品的制备 取流式管10个，用倍比稀释法稀释细胞因子标准液并标记，浓度依次为1250 pg/ml、625 pg/ml、312.5pg/ml、160 pg/ml、80 pg/ml、40 pg/ml、20 pg/ml、10 pg/ml、5pg/ml、0 pg/ml。 1.5.2 混合人Th1/Th2细胞因子捕获微球 每种细胞因子捕获微球悬液剧烈振荡后各取5ml×检测管数（包括标准管及待测样本管），混匀，2000转离心5min后去上清液，加与上面细胞因子同体积的的血清强化液，混匀，避光30min。 1.5.3 制备检测样品 将样本取出平衡至室温，取10只标准管及待测样本管，每管加25ul混合的细胞因子捕获微球和25ulPE标记的Th1/Th2类细胞因子抗体，然后分别在标准管中加入25ul已稀释好的细胞因子标准液，待测样本管中加入25ul待测样本，混匀，室温下避光孵育3小时。 1.5.4 按试剂盒要求，设置微球调整电压。 1.5.5 流式细胞仪检